耐氨苄西林流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶机制探究.docVIP

耐氨苄西林流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶机制探究 　　　摘　要　目的：探讨耐氨苄西林的流感嗜血杆菌产生β-内酰胺酶的机制。：对临床分离的112株流感嗜血杆菌耐药菌用纸片法作β-内酰胺酶测定，用PCR法检测产酶流感嗜血杆菌中的β-内酰胺酶基因的存在。结果：纸片法测得产酶菌株32株，产酶率28.6％(32/112)；32株产酶菌中PCR法测β-内酰胺酶基因阳性菌株29株，阳性率为90.6%(29/32)，其中质粒DNA模板组阳性为25株，基因组DNA模板组阳性为4例。结论：(1)流感嗜血杆菌耐氨苄西林主要由质粒介导产生β-内酰胺酶所造成。(2)PCR法是流感嗜血杆菌是否携带β-内酰胺酶基因及该基因所在位置的简便而有效的方法。 　　自1972年第一次发现流感嗜血杆菌因产β-内酰胺酶而致耐氨苄西林以来［1］，国外对耐氨苄西林流感嗜血杆菌的耐药机制以及产β-内酰胺酶的分子基础研究,呈逐年增加趋势。1978年Bryan等［2］首次报道了质粒介导产生β-内酰胺酶的流感嗜血杆菌。此后，围绕流感嗜血杆菌中的质粒编码β-内酰胺酶及其与耐氨苄西林的关系进行了许多研究。我国由于流感嗜血杆菌的分离率较低，对此的研究一直没有深入。本文作者在本实验室成功提高流感嗜血杆菌分离率的基础上［3,4］，分离获得36株耐氨苄西林的流感嗜血杆菌，用纸片法测定它们产β-内酰胺酶的情况后，用PCR方法对产酶菌中β-内酰胺酶基因的存在与否进行了检测，对耐氨苄西林的流感嗜血杆菌产生β-内酰胺酶机制作了初步。 毕业论文 　　1　材料和方法 　　1.1　流感嗜血杆菌的分离培养　收集痰或咽拭子标本，于1 h内接种于改良的哥伦比亚巧克力琼脂平板中，置5% CO2孵箱，37℃孵育18～24 h,对疑似流感嗜血杆菌的菌落分别于血琼脂和营养琼脂平板上作卫星试验，仅在血琼脂平板上卫星试验阳性者为流感嗜血杆菌。用常规的纸片法（K-B法）对每个菌株作体外药物敏感试验，根据美国NCCLS标准判读药敏结果。从平板上挑取耐氨苄西林的单菌落接种于含3 ml液体HTM培养液的试管中，于5% CO2孵箱37℃孵育培养过夜，离心收集菌体用于质粒制备等后续实验。 　　1.2　纸片法测定β-内酰胺酶　将流感嗜血杆菌培养物经超声裂解后直接涂布于β-内酰胺酶纸片上，在15 min内变红者为阳性。超声仪为Branson Sonifier 250，β-内酰胺酶纸片购自Oxid公司。 　　1.3　PCR法检测β-内酰胺酶基因 　　1.3.1　PCR引物　针对β-内酰胺酶结构基因的PCR引物由本校分子遗传学开放实验室用PCGENE软件PCRPLAN程序设计，上海生工生物工程公司协助合成。引物序列为：上游引物：5′TGGGTGCACGAGTGGGTTAC3′，下游引物：5′TTATCCGCCTCCATCCAGTC3′。 　　1.3.2　PCR反应条件　用PE2400型DNA扩增仪,50 μl PCR反应体系中含有模板DNA 1 μl、上游下游引物各1 μl（浓度为25 μmol/L），10×缓冲液5 μl，dNTP混合物（10 mmol/L）4 μl，并用ddH2O补足至50 μl（Mg2+的终浓度为1.5 mmol/L），以94℃ 3 min→(94℃ 1 min→55℃ 1 min→72℃ 1 min，循环30次)→72℃ 7 min→4℃保温。PCR反应后取10 μl产物点样，进行琼脂糖凝胶电泳并拍照。 毕业论文 　　1.3.3　PCR模板的制备　细菌质粒DNA用常规碱裂解法分离、RNase Ⅰ消化、酚/氯仿抽提纯化［3］；细菌基因组DNA用菌体冻融法制备：取少量细菌于1.5 ml塑料离心管中，用蒸馏水重悬，加入少量溶菌酶于37℃水浴5 min，放入液氮迅速冰冻5 min，取出后立即放入37℃水箱融化5 min，重复冻融3次，室温下1×104 r/min离心5 min，吸取上清液到新的离心管，加入1.5倍 体积的无水乙醇于-20℃沉淀30 min，1.5×104 r/min离心沉淀，用10 μl TE溶解后备用。 　　2　结　果 　　2.1　流感嗜血杆菌的分离　自1997年10月至1998年11月,从我院呼吸内科及耳鼻咽喉科呼吸道感染患者中收集634份痰及咽拭子标本，分离鉴定出112株流感嗜血杆菌,其中，药敏试验证明为氨苄西林耐药的36株。 　　2.2　β-内酰胺酶检测结果　36株耐氨苄西林流感嗜血杆菌中，纸片法测得产酶菌株32株，耐药菌中产酶率88.9%(32/36)。 　　2.3　PCR法检测β-内酰胺酶基因结果　用针对β-内酰胺酶基因的上游和下游特异性引物扩增后，阳性条带大小为486 bp，扩增结果与预期值相同。32株产酶菌中PCR阳性菌株29株，阳性率为90.6%。其中以质粒为模板P