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肠球菌溶血素表型及基因型检测 　【摘要】 目的观察大鼠全脑照射后海马区肿瘤坏死因子α（TNFα）的动态表达，探讨其在放射性脑损伤急性期的反应发病机理中可能的作用。方法制备大鼠的脑放射诱导损伤模型。利用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术半定量分析大鼠脑放射诱导损伤后海马区在不同时间、不同剂量水平TNFα基因转录的动态表达。结果正常组海马区TNFα mRNA低水平表达；全脑照射组表达上调并在1 h达峰值，是正常组的4～11倍（Plt;0.001）；放射诱导呈剂量依赖性（Plt;0.01），30 Gy组较2 Gy组增高近2倍（Plt;0.001），较15 Gy组增高近1倍（Plt;0.01），15 Gy组也高于2 Gy组；各照射组在12 h后恢复到基础水平。结论大鼠全脑照射后海马区TNFα基因表达上调，放射诱导呈剂量依赖性，提示参与了脑放射诱导损伤急性期的细胞反应。 【关键词】 肿瘤坏死因子α 脑损伤 海马 疾病模型 动物 放射性脑损伤是头颈部肿瘤提高放射治疗疗效的重要障碍之一，一些亚急性期和晚期并发症的影像学和组织学变化已比较明确，但急性期的细胞和分子反应以及如何进展为晚期损伤的机理目前尚不清楚。已有实验证实诱发脑损伤的一个重要因素是细胞因子的过度表达，损伤特征性变化如脑水肿、神经胶质增生及脱髓鞘都与前炎性细胞因子的产生密切相关[1]。肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种典型的细胞因子，在各种损伤反应的分子网络中都有重要作用，如在脑放射诱导损伤各反应期都可观察到与其它细胞因子不同的变化[2]。笔者观察大鼠脑放射诱导损伤后海马区TNFα mRNA的动态表达，探讨其在放射性脑损伤早期的反应机制中可能的作用。 1材料与方法 1.1动物 1.1.1模型制作6～8周龄SD雌性大鼠100只由厦门大学动物中心提供[动物合格证号为SCXK（沪）20040005]，体质量(200±20)g。脑放射诱导损伤模型参照文献[3]制作。3.6%水合氯醛按1 mL/100 g麻醉，予直线加速器4 MeV电子线全脑照射，照射范围包括双眼至耳根区域。 1.1.2分组按不同单次照射剂量2，15，30 Gy和照射后不同观察时间1，6，12，24，48 h和7 d分为18组，另设假照射组（麻醉后不进行照射）和正常组（不麻醉不照射）为对照，共计20组，每组5只。断头处死后随机取一侧海马，立即置于无RNA酶的Ep管中，-196 ℃液氮保存。 1.2方法 1.2.1总RNA的提取按说明书用Trizol试剂(上海生物工程公司)提取总RNA。经紫外分光光度计测定D（260 nm）/D（280 nm）在1.7～2.0，计算总RNA含量，电泳证实18 S和28 S条带清晰。 1.2.2逆转录合成cDNARNA 2 μg以Oligo(dT)18为引物，20 μL反应体系在70 ℃预变性5 min；再加入5×RT buffer、dNTP、RNasin和MMLV共40 μL，体系在37 ℃反应45 min。 1.2.3PCR扩增取cDNA 5 μL用于扩增。50 μL反应体系中加入10×buffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、正义和反义引物。PCR的反应条件为94 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，共33个循环。以βactin为内参照，扩增产物7.5 μL和βactin 5 μL混合在1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果采用计算机数字扫描密度影像分析仪进行半定量分析。PCR所采用的引物根据Genebank及软件设计,由上海生物工程公司合成。序列如下： TNFα（438 bp）： F：5′GGT GAT CGG TCC CAA CAA GG3’ R：5′CCT CCC AGG TAC ATG GGC TC3 βactin （332 bp）： F：5′CTG GAG AAG AGC TAT GAG C3 R：5′AGG ATA GAG CCA CCA ATC C3 1.3统计学处理以内参照βactin光密度值标化TNFα光密度值，得到TNFα的相对含量，结果用x±s表示。应用SPSS 11.0软件进行统计分析。对时间和照射剂量作双因素F检验，对有显著差异组样本均数作t检验。 　 2结果 全脑照射前海马区TNFα mRNA表达维持在低水平，照射后基因表达上调（Plt;0.001），随照射剂量的增加而增高（Plt;0.001），在1 h达高峰，是正常组的4～11倍，6 h仍显著高于正常，12 h后表达均恢复到基础水平，在7 d内未见再次上升；在6 h时间点15 Gy组数值较2 Gy和30 Gy组低，差别有统计学意义。照射组与正常组、假照射组比较，结果相同，提示麻醉不影响实验结果（图1，表1）。 表1大鼠