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脱氧核酶抑制细菌TEM-1 β-内酰胺酶基因表达实验探究 　 作者：刘刚 凌保东 谢勇恩 林丽 赵廷坤 雷军 【摘要】 目的 观察10-23脱氧核酶对细菌TEM-1酶基因表达的抑制作用。方法 PCR扩增TEM-1酶全编码基因，将其连接入pBK-CMV载体中，并在大肠埃希菌JM109中表达。设计并合成针对blaTEM-1的10-23脱氧核酶、反义寡核苷酸，采用氯化钙法将其分别导入表达blaTEM-1的大肠埃希菌中，观察细菌导入脱氧核酶后，在含氨苄西林(100μg/ml)培养基中的生长活力及β-内酰胺酶活性的变化。结果 10-23脱氧核酶导入表达blaTEM-1的大肠埃希菌后，在含氨苄西林(100μg/ml)的培养基中大肠埃希菌的生长活力明显低于反义寡核苷酸和空白对照组，导入脱氧核酶的大肠埃希菌β-内酰胺酶活性也明显低于反义寡核苷酸和空白对照组。结论 10-23脱氧核酶能特异性地抑制细菌blaTEM-1酶基因表达。 【关键词】 耐药性； β-内酰胺酶； 脱氧核酶； 基因表达 ABSTRACT Objective To investigate the inhibitory effects of 10-23 deoxyribozyme (10-23 DRz) on blaTEM-1 gene expression in E.coli. Methods blaTEM-1 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR), the target amplification fragment was cloned into PBK-CMV vector. The recombinant vector was sequenced by Sanger′s dideoxy chain termination composition method. According to the gene sequence of blaTEM-1, 10-23 DRz and antisense oligonucleotides (As-ODN) were designed, synthesized, and introduced into E.coli producing TEM-1 respectively by the CaCl2 procedure, bacterial viability in liquid medium containing ampicillin (100μg/ml) and β-lactamase activity were detected spectrophotometrically. Results A600 value of E.coli incubated with 10-23 DRz was lower, compared with that of corresponding group (Plt;0.05). β-lactamase activity of 10-23 DRz group was also lower than that of corresponding group (Plt;0.01). Conclusion 10-23 DRz could specifically inhibit the blaTEM-1 expression in E.coli. KEY WORDS Resistance; β-Lactamases; Deoxyribozyme; Gene expression 针对细菌产生β-内酰胺酶是导致其对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因［1～3］，近年来，国内外学者致力于探索抑制β-内酰胺酶的有效措施并研制出了一系列的β-内酰胺酶抑制剂，如克拉维酸，舒巴坦、三唑巴坦等，但随着β-内酰胺类抗生素与酶抑制剂复合制剂在全球范围的广泛使用，对酶抑制剂耐药的β-内酰胺酶也随之不断出现［3］，为临床用药带来巨大困难。探索其它方法、措施以解决β-内酰胺酶所导致耐药问题意义重大，本实验以耐药基因blaTEM-1的mRNA为靶点，观察10-23脱氧核酶作为新型酶抑制剂的抑酶效应，为研制开发新型抗感染性疾病基因治疗药物提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 菌株 产TEM-1型β-内酰胺酶菌株、大肠埃希菌JM109及PBK-CMV载体为本所保存。 1.2 主要试剂 氨苄西林(齐鲁制药厂)； 质粒DNA小量快速制备试剂盒、dNTP、Taq酶和PCR反应配套试剂(上海申能博采公司)；DNA DL2000 Marker、限制性内切酶EcoRI、BamHI和DNA连接试剂盒(宝生物大连有限公司)。 1.3 主要仪器 TU-1901双光束紫