苏木素及胰蛋白酶作用性质探究.docVIP

苏木素及胰蛋白酶作用性质探究 　 作者：黄忠林， 宋九华， 王应红 【摘要】 　　目的认识苏木素对胰蛋白酶作用活性的影响及苏木素对胰蛋白酶作用的荧光性质。方法用酶活性法观察苏木素对胰蛋白酶活性的影响；用紫外光谱和荧光光谱研究苏木素对胰蛋白酶作用的光谱性质。结果苏木素对胰蛋白酶活性可产生竞争性抑制，抑制剂常数K1=6.13×10-5 mol/L；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力。结论苏木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所处环境的疏水性增强，使胰蛋白酶分子构象发生变化。 【关键词】 苏木素 胰蛋白酶 荧光光谱 紫外光谱 酶活性 中药苏木的主要成分苏木素(Haematorylin)是组织、病理实验室中最常用的染色剂，可用于细胞核染色［1］。苏木素具有收缩血管、中枢抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消肿、止痛的功效［2］。胰蛋白酶(trypsin)是人和动物肠道中一种重要的蛋白水解酶，从该酶被发现以来，人们对其进行了一定的研究，如用胰蛋白酶为催化剂对蛋白质进行降解的研究［3～5］。药物对胰蛋白酶作用的性质［6］及苏木素与DNA作用的性质的研究已引起重视［7］。本文主要通过紫外和荧光光谱法研究苏木素与胰蛋白酶作用的性质，从而获得苏木素与胰蛋白酶作用时结构变化、所处微环境等信息，探讨苏木素与胰蛋白酶相互作用的机制，并对苏木素与胰蛋白酶作用活性的影响也进行了研究。 　　1 器材 　　1.1 仪器荧光分光光度计，美国Cary Eclipse（瓦里安）产品；双光束紫外可见分光光度计TU－1901，北京普析产品；pH－3C型酸度计，上海精密科学仪器有限公司产品。 　　1.2 药品牛胰蛋白酶（生化试剂），上海海洋生物技术有限公司产品；苏木素（生物染色剂BS），成都科龙化工试剂厂产品；硼酸（分析纯 ），成都科龙化工试剂厂产品。 　　2 方法 　　2.1 苏木素对胰蛋白酶活性影响在恒温水浴箱中将酪蛋白、胰蛋白酶和苏木素预热，按酶活性的测定方法，在胰蛋白酶与酪蛋白的酶解反应体系中加入不同体积的苏木素溶液，测定苏木素对酶活性的影响。胰蛋白酶活性及抑制常数测定参照文献［8］方法操作。 　　2.2 苏木素对胰蛋白酶紫外光谱的影响配制pH＝7.5的硼酸缓冲溶液（内含0.1 mol/L CaCl2维持离子强度）；用硼酸缓冲溶液配制1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液，再用3次蒸馏水分别配制2.0×10-3mol/L和1.0×10-3mol/L的苏木素溶液。 室温条件下，在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，扫描190～350 nm的吸收光谱。然后用微量注射往其中准确加入1.0×10-3mol/L的苏木素溶液10 μl，混匀，静置2 min后扫描190～350 nm的吸收光谱。扫描1.0×10-3 mol/L苏木素溶液190～350 nm的吸收光谱。 　　2.3 苏木素对胰蛋白酶荧光光谱影响在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入 1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，用微量注射器分别加入2.0×10-3mol/L的苏木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70 μl。每次加入后混匀，放置5 min，分别在20，25，30，35℃下，测定其荧光光谱，激发波长为280 nm，绘制288～450 nm的荧光光谱。 　　2.4 苏木素对胰蛋白酶作用的同步荧光将“2.3”项下所配的温度为298 K的溶液，固定激发和发射波长间隔△λ分别为20 nm和60 nm，同时扫描激发和发射波长并记录同步荧光光谱。 　　3 结果 　　3.1 苏木素对胰蛋白酶活性的影响苏木素对胰蛋白酶有抑制作用，当苏木素浓度为4.5×10-4 mol/L时，苏木素使胰蛋白酶的相对活性下降到70.2%，抑制率为29.8%。在不同的底物浓度（40，30，20，10 g/L酪蛋白溶液）下，按酶活性的测定方法测定酶的反应速度，其结果以1/v对抑制剂量用Dixon作图法求出Ki=6.13×10-5mol/L，抑制类型为非竞争性抑制。 　　3.2 苏木素对胰蛋白酶紫外吸收光谱影响图1为T＝298K，pH＝7.4时的吸收光谱。蛋白质分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基均有紫外吸收，蛋白质的吸收波长一般在280 nm附近。从图1可以看出，当往胰蛋白酶中加入苏木素后，混合溶液在280 nm附近的吸收峰均明显增高，说明苏木素与胰蛋白酶之间发生了作用，改变了胰蛋白酶的构象,而这种作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基的π－π*电子跃迁。 　 　　3.3 荧光光谱以λex＝280 nm，胰蛋白酶在354 nm附近有很强的荧光峰；而以同样激发波长激发苏木素溶液，在35