豆根管食通口服液对人食管癌细胞端粒酶活性影响实验探究.docVIP

豆根管食通口服液对人食管癌细胞端粒酶活性影响实验探究 　【摘要】 　　目的观察豆根管食通口服液体外对Eca-109细胞毒性及端粒酶活性的影响，从细胞分子水平探讨该药的作用机制。方法实验选择人Eca-109细胞株，采用MTT分析法，测定不同浓度豆根管食通口服液单用及与5-氟脲嘧啶(5－Fu)合用对Eca-109细胞的直接细胞毒作用；采用端粒重复序列扩增法(TRAP)、酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测端粒酶的活性变化。结果①豆根管食通口服液对Eca-109细胞的细胞毒作用：MTT结果显示对Eca-109细胞的生长有明显的抑制作用，各实验组与正常对照组OD值的差异有统计学意义，且在一定的浓度范围内存在剂量依赖性。②豆根管食通口服液对Eca-109细胞端粒酶活性的影响 采用TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性， 1倍及2倍的IC50豆根管食通口服液与对照组相比存在非常显著性差别；24 ～72 h各实验组和端粒酶阳性对照组相比均有非常显著性差异（P﹤0.01）；3个剂量中药培养食管癌Eca-109细胞至相同时间段，其端粒酶活性表达显示出一定的量效关系，在0.5倍至2倍IC50之间，呈现出正相关。结论①豆根管食通口服液在体外具有明显抑制Eca-109细胞的作用，与药物浓度呈正相关；②在一定的浓度范围内豆根管食通口服液可下调Eca-109细胞的端粒酶活性；③抑制端粒酶活性可能是豆根管食通口服液的抗癌机制之一。 【关键词】 豆根管食通口服液； Eca-109细胞； 食管癌； 端粒酶 　　食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。中国是世界上食管癌的高发国家，也是目前世界上食管癌死亡率最高的国家，平均年死亡率为17.38/10万，居恶性肿瘤死亡的第四位，在河南省更是位居恶性肿瘤之首［1］，目前治疗仍以手术、放化疗为主要手段，其临床治疗效果不甚满意，5年生存率不到15%［2］，而中医药在肿瘤的综合治疗中具有独特的优势。现代研究认为，食管癌的形成既非单纯环境所致，也非仅仅遗传素质所为，而是发生在食管上皮单纯增生、不典型增生、原位癌、浸润癌整个自然病史中的多因素、多阶段、多基因变异累积及其相互作用的复杂过程。以分子生物学的观点认识疾病，可以说，疾病都是以症状为表型，直接或间接地与基因相关的基因病。食管癌的发生和演进除了涉及多个癌基因、抑癌基因的异常外，还存在另一非常重要的生物学特性，即以细胞的永生化来维持它的无限生长。端粒与端粒酶在近年已受到国际生物学界高度重视，是肿瘤研究的热点之一，它们与细胞衰老、分裂、永生化和癌变有密切关系。端粒酶的激活与食管癌的发生发展密切相关，并可能为食管癌的治疗提供新途径。我们采用端粒重复序列扩增法(TRAP)，酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测了豆根管食通口服液对人食管癌Eca-109细胞端粒酶活性的影响。 　　目前，端粒及端粒酶已被广泛认为可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的靶点，对于端粒和端粒酶的进一步深入研究，不仅有助于人们更好地理解肿瘤发生的可能机制，而且可为人们通过检测端粒酶的活性来预测细胞的恶变倾向，以及抑制端粒酶的活性而进行肿瘤治疗提供了一个良好的途径。 　　1 材料与仪器 　　1.1 试剂RPMI-1640培养粉，美国GIBCO公司产品；胎牛血清(FBS，200ml/瓶)，天津TPD血液研究所产品；四甲基偶氮哇盐［3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenylte-2H- tetrazoliumbromide,MTT ］，瑞士Fluka产品；二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），天津市登峰化学试剂厂产品；5-氟尿嘧啶注射液(5-Fu)：上海旭东海普药业有限公司产品（250 mg/10 ml），批号：031002，实验前配成所需浓度；多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine )，北京中山生物技术有限公司产品。聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)，美国Sigma产品；浓缩型3, 3’一二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)试剂盒，北京中山生物技术有限公司产品；端粒酶PCR-ELISA检测试剂盒(Telo TAGGG Telomerase PCR ELISAILUS )，德国Roche公司产品。 　　1.2 仪器烘箱、96孔培养板、24孔培养板，美国Costar公司产品；微量移液器，芬兰Biohit公司产品；CO2培养箱，美国Forme公司产品；超净工作台，苏州净化设备厂产品；显微镜：倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品，光学显微镜，XSZ-G型，重庆光学仪器厂产品；低速大容量多管离心机LXJ－HB型，上海安亭科学仪器厂产品；GL－20G－H型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂产品；TGL－16G型高速冷冻离心机，上海安亭