转化生长因子βⅡ型受体基因突变在大肠腺瘤癌变过程中作用.docVIP

转化生长因子βⅡ型受体基因突变在大肠腺瘤癌变过程中作用 　 作者：王朝晖，张雪梅，姜春萌，应力 【摘要】 目的 探讨转化生长因子β（TGFβ）Ⅱ型受体基因突变、微卫星不稳定性（MSI）在大肠腺瘤癌变过程中的作用。方法 选用BAT26微卫星位点应用PCRSSCP银染方法鉴定大肠腺瘤及大肠癌组织MSI状态，并检测TGFβⅡ型受体突变热点cDNA709718在大肠腺瘤、大肠癌中的突变情况及其与大肠癌临床病理特征的关系。结果 本实验选取的60例大肠癌中TGFβⅡ型受体的突变率为26.7%（16/60），42例大肠腺瘤的突变率为11.9%（5/42），且均发生在伴中重度不典型增生的晚期腺瘤中。本组88.8% MSI大肠癌存在TGFβⅡ型受体基因突变。TGFβⅡ型受体突变与大肠癌临床病理特征间有密切关系，其多位于右半结肠，多发生在伴MSI的大肠癌，多为分化不良型腺癌，Dukes A、B期患者比例显著高于Dukes C、D期（P＜0.05）。结论 转化生长因子βⅡ型受体基因突变致细胞失去对TGFβ的生长抑制反应而发生肿瘤可能在大肠腺瘤癌变过程起着重要作用，其可能是MSI大肠癌发生的分子机制，且与大肠癌临床病理特征间有密切关系。 【关键词】 转化生长因子β；受体；突变；大肠腺瘤；大肠癌 Mutation Analysis of Transforming Growth Factor β Ⅱ Receptor Gene in Colorectal Adenoma Carcinogenesis Key words：Transforming growth factorβ；Receptor；Mutation；Colorectal neoplasm；Adenoma 转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）是人体多种上皮组织细胞的负生长调控因子，但研究发现，不同的细胞株对TGFβ的反应不同，并且某些肿瘤细胞存在着逃逸TGFβ负调控作用的现象。因此，细胞对TGFβ负调控作用的逃逸可能是癌变过程中的一个重要环节。进一步研究表明，肿瘤细胞的这一特性可能与其表面的TGFβⅡ型受体（TGFβ receptorⅡ，TGFβRⅡ）基因突变有关，且在大肠腺瘤癌变过程中起着重要作用，本研究应用PCRSSCP（single stranded conformation polymorphism，SSCP）方法对大肠腺瘤及大肠癌组织的微卫星不稳定性及TGFβRⅡ基因的突变热点cDNA709718进行了检测。 1 材料与方法 1.1 研究对象 随机收集1999～2003年我院外科手术切除和纤维结肠镜活检标本，其中大肠癌60例，患者年龄52～72岁，男36例，女24例；大肠腺瘤42例，患者年龄18～70岁，男26例，女16例。所有标本均经病理证实。正常对照取自手术癌旁正常组织或正常活检粘膜，共16例。所有标本均于离体后半小时内液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱中保存待测。 1.2 组织DNA提取 以上标本按常规酚氯仿抽提方法提取组织DNA，溶于0.1mol/L TE溶液中，测定其浓度后-20℃保存待用。 1.3 大肠腺瘤及大肠癌组织TGFβ RⅡ基因突变的检测 1.3.1 组织DNA的PCR扩增 目前研究表明，TGFβ RⅡ基因的突变热点为cDNA709718，因而本研究将对此位点进行检测。TGFβRⅡcDNA709718位点的PCR扩增引物由上海华美生物公司合成，其序列为： Forward 5′AGATGCTGCTTCTCCAAAGTCT3′ Reverse 5′TTGCACTCATCAGAGCTACAGG3′ PCR扩增条件为94℃30s，56℃1min，72℃1min，循环35次后，72℃延长10min。取PCR扩增产物8ul经2%琼脂糖凝胶电泳后，观察90bp的特异性扩增带。 1.3.2 SSCP银染 取8μl PCR反应产物与2倍体积的变性液（95%去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青蓝），97℃变性5min，冰中骤冷，迅速加样，进行8%[丙烯酰胺：甲叉（N，N′亚甲双丙稀酰胺）=49∶1]非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，室温冷凝水循环降温，预电泳150V，30min，电泳280V，至指示剂溴酚蓝走至凝胶下缘（约4h）。取下凝胶，进行硝酸银染色，10%冰醋酸固定15min后，依次进行染色、显色至条带清晰。 1.3.3 结果分析 正常组织和肿瘤组织在同一条件下进行扩增、电泳、银染，如果出现完全一致的电泳条带，则判断TGFβ RⅡ正常；如果电泳中发现肿瘤标本条带增多、丢失或移位，则判断TGFβ