重组pDC316-MCMV- hNIS真核表达质粒构建及在肿瘤细胞功能研.doc

重组pDC316-MCMV/ hNIS真核表达质粒构建及在肿瘤细胞功能研 　 作者：周泉波， 陈汝福， 李志花， 周嘉嘉， 唐启彬， 陈积圣 【摘要】 【目的】 克隆人的钠/ 碘同向转运体(hNIS) 基因可编码序列，并研究其在非甲状腺肿瘤细胞内的功能表达。【方法】 利用逆转录和聚合酶链反应（RT-PCR）从毒性弥漫性甲状腺肿（又称Graves病）病人的甲状腺组织中扩增得到NIS的可编码区基因，并克隆到T载体，测序后亚克隆到腺病毒载体穿梭质粒pDC316载体上，获得重组真核表达质粒载体pDC316–MCMV/ hNIS。采用脂质体转染的方法，把pDC316-MCMV/ hNIS重组质粒（实验组）或pDC316空质粒（对照组）分别导入到胰腺癌细胞株CAPAN-II细胞、PANC-1细胞和卵巢癌细胞株SK-OV-3细胞，转染后48 h采用RT-PCR方法检测转染细胞内的hNIS mRNA水平，转染后第2、3、4天分别检测肿瘤细胞对125I的吸收功能。【结果】 序列分析结果证实克隆片段与文献报道的hNIS基因cDNA序列完全一致。实验组转染后48 h，在CAPAN-II细胞、PANC-1细胞及SK-OV-3细胞内均能检测到hNIS mRNA高水平表达，对照组基本无hNIS mRNA表达。转染后第3天细胞吸碘达到高峰，实验组CAPAN-II细胞、PANC-1细胞和SK-OV-3细胞对125I的吸收量分别比对照组高24倍、17倍和13倍。【结论】 从Graves病人的甲状腺组织中克隆的hNIS基因转染肿瘤细胞后，能使肿瘤细胞发挥高水平吸碘功能，为进一步运用放射性核素体内靶向治疗非甲状腺肿瘤奠定了基础。 【关键词】 人钠/ 碘同向转运体； 逆转录聚合酶链反应； 基因转染； 碘放射性同位素 钠/碘同向转运体(sodium iodide symporter,NIS)是主要存在于甲状腺滤泡细胞基底膜上的一种跨膜糖蛋白,在细胞对碘的摄取过程中起着举足轻重的作用[1]。随着对NIS研究的不断深入，通过NIS基因介导放射性核素来进行肿瘤的基因治疗是目前国内外的研究热点之一[2,3],但在胰腺癌基因治疗中少有报道[4]。本研究从Graves甲亢病人的甲状腺组织中克隆出人NIS基因的完整编码区序列（CDS），并构建Pdc316-MCMV/hNIS重组穿梭质粒载体，以研究NIS基因转染的胰腺癌等非甲状腺肿瘤细胞对碘的摄取功能。 1 材料与方法 1.1 材料 Graves甲亢病人的甲状腺组织取自我院乳甲外科。总RNA提取试剂Trizol reagent和脂质体lipofectamine 2000均为Invitrogen公司产品, 2×Pfu PCR MasterMix（KP201）天为时代公司产品，两步法RT-PCR 试剂盒Takara公司产品。限制性内切酶EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、Hind Ⅲ及T4 DNA 连接酶购自NEB公司。coli DH5α，pDC316 vector由中山大学肿瘤医院实验室提供，pGEM-T easy载体本试验室保存。胰腺癌细胞株CAPAN-2购买于中山大学细胞培养室,胰腺癌细胞株PANC-1、卵巢癌细胞株SK-OV-3由本试验室保存。DMEM培养基（GBICO公司）、四季青胎牛血清为威佳公司产品。放射性125I、NaI及KClO4均由中山大学实验核医学实验室提供。 1.2 NIS基因的扩增及与T载体连接 采用Trizol试剂法从1例Graves甲亢病人的甲状腺组织中抽提总RNA后, 使用TaKaRa公司反转录试剂盒把RNA反转录成cDNA,具体方法参考试剂盒说明书。根据重叠PCR方法设计4条引物以扩增hNIS cDNA全长1932 bp的基因片段：P1: ATGGAGGCCGTGGAGACCGGGGAAC；P2: CAAACATGACGATGCCACAGCAGGC；P3: CAGGT CGTGGTGATGCTAAGTGGCT；P4: TCAGAGGTTTG TCTCCTGCTGGTCT。分别建立如下3个反应体系: 体系1（扩增产物为Fragment 1）：取甲状腺cDNA 1 μL ,P1（10 pmol/L）、P2(10 pmol/L) 各5 μL, 2×Pfu PCR Master Mix 25 μL,ddH2O 14 μL。体系2（扩增产物为Fragment 2）：取P3（10 pmol/L）、P4(10 pmol/L) 各5 μL，其余成份同体系1。体系3（扩增产物为NIS基因片段）：把Fragment 1和Fragment 2的PCR产物稀释50倍后混合，取1 μL此混合物作为模版，P1（10 pmol/L）、P4(10 pmol/L)各5 μL，其余成份同体系1。3个体系PCR反应的条件一致，如下:94