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金黄色葡萄球菌生物膜对茶树油抵抗性探究 　 作者：黄晓敏 王婧婷 陈春营 李海妙 林良佳 余晓铃 曾穗红 【摘要】 目的研究金黄色葡萄球菌生物膜对茶树精油的抵抗力。方法采用Brown平板改良法体外复制金黄色葡萄球菌生物膜模型，扫描电镜确认后应用载体定量杀菌实验对其进行实验研究。结果培养3 d的金黄色葡萄球菌生物膜对体积分数2.0％的茶树油耐受时间最短，作用20 min完全被杀灭；培养7 d的金黄色葡萄球菌生物膜对体积分数0.75％茶树油耐受时间最长，作用120 min才被完全清除，用金黄色葡萄球菌浮游菌滴染滤膜经体积分数2.0％茶树油处理后，均在10 min内被完全杀灭。 结论形成生物膜的细菌对茶树油的抵抗力比浮游菌强，随着生物膜形成时间延长，抵抗力明显增加。 【关键词】 茶树油 金黄色葡萄球菌 生物膜 抵抗力 茶树油 （Tea Tree oli）是桃金娘科（Myrtaceae）白千层属（ Melaleuca）灌木树种-互叶白千层（Melaleuca alternifolia）的新鲜枝叶经水蒸气蒸馏得到的芳香精油。近年来，茶树油抗菌作用的研究成为国际上的研究热点，体外抗菌实验表明茶树油具有明显的广谱抗菌效应［1］，是一种具有抗菌活性的天然产物。 　　金黄色葡萄球菌是细菌生物膜的主要形成菌，亦是静脉导管或其他医疗装置相关感染的主要致病菌，金黄色葡萄球菌生物膜一旦形成致使抗生素、化学消毒剂等均难以渗透，且易产生耐药性。研究表明，细菌生物膜（Bacterial Biofilm， BF）是多种病原微生物常见的污染方式，如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌等，这些能形成生物膜的致病菌和条件致病菌已成为医院内感染的主要病原菌，也是医用材料发生细菌污染的重要原因。为研究金黄色葡萄球菌生物膜对茶树精油的抵抗力，采用Brown平板法［2］改良，体外复制金黄色葡萄球菌生物膜模型，并运用载体定量杀菌实验对其进行实验研究。现报道如下。 　　1 器材与方法 　　1.1 菌株 选择临床分离的2株金黄色葡萄球菌YB03、YB17，来源于广东省粤北人民医院住院患者静脉插管黏附菌，经本学院微生物学实验室TDR-200B全自动型微生物分析仪检测鉴定证实。按文献［3］进行生物膜定性，以确定能产生生物膜的金黄色葡萄球菌。受试菌培养采用LB肉汤，LB琼脂平板，pH 7.4 PBS等均为本实验室配制。 　　1.2 药物 茶树油原液为广州奥博贸易有限公司产品，批号DA031－AU（茶树油品质符合国际化标准组织规定的茶树油中14种主要成分的组成范围ISO4730标准［4］)；取茶树油原液与吐温80各10 ml，将吐温80缓慢滴入茶树油中并振荡使其乳化成乳化液，经0.22 μm孔径滤膜滤过除菌4 ℃冰箱保存。 　　1.3 试剂和仪器 TDR-200B全自动型微生物分析仪（长沙天地人生物科技有限公司）， 721分光光度计（上海第三分析仪器厂）， Olympus 光学显微镜，日立CO2 临界点干燥仪， 日立 HCP-2离子溅射仪， 日立 E-1010扫描电子显微镜（日本日立公司）。 　　1.4 生物膜制备 采用Brown平板法［2］并进行改良,将复苏后传代培养16h的金黄色葡萄球菌接种于LB肉汤中37℃培养过夜，用无菌生理盐水离心洗2次，再用生理盐水重新悬浮。用分光光度计560 nm 测定其吸光度值，使菌悬液的A值达0.029（相当细菌数约为1.5×106 CFU/ml）。将此菌悬液用LB肉汤稀释10倍，注入1.5×15 cm无菌试管内5 ml，同时加入已灭菌的制备成1.0 cm×1.0 cm的一次性输液管片（已压平）， 37 ℃培养，隔2 d换1次LB肉汤连续培养7 d，即可形成成熟的金黄色葡萄球菌生物膜。 　　1.5 中和剂选择实验 以金黄色葡萄球菌作为指标菌，按中华人民共和国卫生部2002版的《消毒技术规范》执行，设平行6组（分组情况见表1）进行载体定量鉴定试验。结果第6组不长菌，第1组不长菌或长菌少于第2组，第2组长菌数≥100 CFU/ml，第3，4，5组组间菌数在1.0×105～1.0×106 CFU/ml之间，组间菌量误差率≤15％，表明所选中和剂及浓度适宜。实验重复3次。 　　1.6 生物膜形成的显微鉴定 从菌悬液中取出已培养3 d 和7 d的BF的载体，经无菌生理盐水冲洗去除浮游细菌，单染色，光学显微镜油镜观察可见排列紧密的葡萄球菌细菌层，弃去。取同时培养的其他BF载体膜，用pH7.2的0.1 mol/L PBS（4℃预冷）漂洗，在4℃环境中，以2.5%的戊二醛（为本实验室配制）固定4 h；用PBS漂洗3次，15 min/次；按50%，70%，90%，100%体积分数系数的乙醇梯度脱水，每梯度15 min，其中100%乙醇脱水3次；用醋