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随机扩增多态性DNA标记技术及其在药用植物探究中应用 　 作者：王晓慧 汤晓闯 杨恩秀 姜程曦 董建勇 黄志锋 【摘要】 随机扩增多态性DNA（RAPD）技术是近年来广泛应用的分子标记技术之一，以PCR反应为基础，其特点是快速简便、易操作、成本较低，DNA需要量少、无需放射性分析，也不会污染等。该文简述了RAPD技术的原理及优缺点以及其在药用植物遗传多样性分析、药材鉴别和DNA指纹图谱的构建、亲缘关系及系统学研究、药材的道地性等方面的应用，并展望了其发展前景。 【关键词】 随机扩增多态性DNA 遗传多样性 药材鉴别 道地性 分子标记（Molecular marker）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映，以其快速、准确、所提供的信息量大、不受环境影响等特点，已被广泛应用于遗传学评价、目的基因定位和遗传图谱的构建等领域。随机扩增多态性DNA（RAPD）技术是近年来广泛应用的分子标记技术之一，以PCR反应为基础，其特点是快速简便、易操作、成本较低、DNA需要量少、无需放射性分析也不会污染等［1］。 　　1 RAPD技术的原理 　　RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美国杜邦公司科学家 J. G. K. Williams 和加利福尼亚生物研究所 J. Welsh 领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新的分子标记技术。Williams 称之为 RAPD，Welsh 称之为 AP-PCR（arbitrary primer PCR）。 其建立在 PCR 技术基础上，是以任意序列的寡核苷酸单链 ( 通常为10个碱基，AP-PCR 则为20～30个碱基) 为引物，对所研究的基因组 DNA 进行随机扩增。RAPD 所用的一系列引物的 DNA 序列各不相同，但对于任一引物，它同基因组 DNA 序列有特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR 扩增的反应条件，即在一定范围内模板 DNA 上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范围的 DNA 片段。在不同物种基因组 DNA 中，这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点分布发生相应的变化，而使 PCR 扩增产物增加、减少或发生分子量的变化。 通过对 PCR 产物的检测和比较，即可识别这些物种基因组 DNA 的多态片段。 　　2 RAPD技术的优缺点 　　2.1 RAPD技术的优点分子标记的种类很多，RAPD标记技术能够成为最广泛应用的分子标记技术之一，是因为与其它分子标记技术相比，有很多独特的优点［2］。 　　①不需DNA探针，设计引物也不需要知道序列信息；②用一个引物就可扩增出许多片段(一般一个引物可扩增6～12条片段，但对某些材料可能不能产生扩增产物)，总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法；③技术简单，RAPD分析不涉及Southern杂交、放射自显影或其它技术；④不象RFLP分析，RAPD分析只需少量DNA样品；⑤成本较低，因为随机引物可在公司买到，其价格不高；⑥无需专门设计 RAPD 扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的［3］。⑦每个RAPD 反应中，仅加单个引物，通过引物和模板 DNA 链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。⑧较之常规 PCR，RAPD 反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量 DNA 分子标记，可以借助计算机进行系统分析。 　　2.2 RAPD技术的缺点RAPD技术虽然有很多优点，但是也不可避免的存在一些缺点：①RAPD标记一般是显性遗传(极少数是共显性遗传的)，这样对扩增产物的记录就可记为“有/无”，但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子；②RAPD分析中存在的最大问题是重复性不太高，因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变；但是，如果把条件标准化，还是可以获得重复结果的；③由于存在共迁移问题，在不同个体中出现相同分子量的带后，并不能保证这些个体拥有同一条(同源)的片段；同时，在胶上看见的一条带也有可能包含了不同的扩增产物，因为所用的凝胶电泳类型(一般是琼脂糖凝胶电泳)只能分开不同大小的片段，而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。 　　3 RAPD技术在药用植物研究中的应用 　　目前，RAPD技术在药用植物研究中得到了广泛的应用。其主要用于药用植物遗传多样性分析，药材鉴别和DNA指纹图谱的构建，亲缘关系和系统学研究，药材的道地性等各个领域。此外，Kitanaka还用RAPD技术对人参和西洋参的杂交一代进行了鉴定。 　　3.1 遗传多样性分析对于任何一个物种来说，其遗传多样性越丰富，对环境变化的适应能力就越强，就越容