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CpG ODN序列结构特征对免疫活性影响探究进展 　【关键词】 CpG ODN; CpG 基序; 免疫刺激; 序列结构 　　CpG ODN（CpG oligonucleotide, CpG 寡脱氧核苷酸）是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）的寡脱氧核苷酸(ODN), 可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞。它能直接激活B细胞和单核细胞(巨噬细胞和树突状细胞), 间接激活NK细胞和T细胞等多种免疫效应细胞, 增强其功能和细胞因子的分泌, 增强抗原的加工提呈, 诱导Th1型免疫应答, 产生较强的体液免疫和细胞免疫, 增强特异性和非特异性免疫反应。可治疗肿瘤、 过敏反应性疾病、 感染性疾病和免疫功能低下的患者。国外已对目前对人免疫刺激活性最强的CpG ODN 7909进行了多项的临床试验, 包括对黑色素瘤、 非小细胞肺癌、 皮肤T细胞淋巴瘤、 非霍奇金淋巴瘤等肿瘤的Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期临床试验, 以及对HBV、 HCV等感染性疾病的Ⅰ/Ⅱ期临床试验［1-3］, 证实是一种高效低毒的新型免疫治疗剂和佐剂, 并已申请专利。目前国内的研究尚处于体外实验和动物试验阶段, 尚无具有独立知识产权的CpG ODN序列。 　　CpG ODN是多个脱氧核苷酸有规律的排列, 其组合形式多样。而不同序列结构特征的CpG ODN免疫活性相差很大, 改变序列中的某一个或某几个核苷酸都可能会极大地影响其免疫活性, 这是设计免疫活性CpG ODN的理论基础。通过研究总结并掌握CpG ODN的构效关系对于合成和筛选对人有效的CpG ODN序列有重要意义。 　　1 CpG ODN的结构特征及分类 　　非甲基化的CpG二核苷酸为核心的六核苷酸特征结构, 即CpG及其上游、 下游各2个核苷酸所组成的六聚体, 是奠定CpG ODN免疫刺激作用的序列元件, 它是CpG ODN免疫刺激活性的核心结构。Krieg称其为CpG基序(CpG motif), Sato等则称其为免疫刺激序列(ISS, immunostimulatory sequences)。根据CpG ODN的骨架结构特点、 免疫活性、 免疫细胞识别特征的差异对其进行分类, 以便深入了解其构效关系, 从而更有针对性地设计具有不同治疗目的CpG ODN。 　　1.1 根据骨架分类 CpG ODN有两种骨架: (1)磷酸二酯骨架（phosphodiester, PO）, 即相邻的核苷酸以磷酸二酯键相连; (2)硫代磷酸骨架（Phosphorothiate, PS/PTO）, 即磷酸二酯键中一个非桥联氧原子被硫取代。这种取代与其细胞摄取能力和抵抗3’端核酸外切酶的消化能力密切相关, 从而影响其活性。 　　1.2 根据外周血单个核细胞对CpG核心序列识别特征分类 根据CpG ODN活化人外周血单个核细胞（PBMC）亚群和产生的免疫效应的区别可将其分为两类, 分别称为D型和K型［4］。Krieg将上述两类ODN分别命名为CpGA ODN和CpGB ODN。各型结构特征和免疫效应的区别如表1所示。 　　近年来, 一种新型的CpG ODN逐渐被人们识别, 这种ODN既能活化B细胞, 诱导人PBMC分泌Ⅰ型IFN, 还可以明显增强PBMC中NK细胞的细胞毒作用。这种ODN被定义为C型ODN, 即CpGC ODN。其结构特征为: (1)5′末端或者靠近5′末端有12个TCG三核苷酸。(2)至少有10～12个碱基构成的回文序列, 最好在3′端, 其中至少有2组CG二核苷酸［5］。(3)由poly T连接。 　　表1 3型CpG ODN的比较（略） 　　这种分类方法对CpG ODN临床应用具有重要的意义。在进行肿瘤的临床治疗时, 可以根据机体对不同的抗肿瘤机制选择应用不同的CpG ODN 以达到治疗目的: 如果以NK细胞杀伤肿瘤细胞为主要机制, 则选择A型ODN, 如果以诱导记忆性免疫应答及抗瘤抗体的作用为主要机制, 则选择B型ODN［6］。治疗病毒感染性疾病时, 首先选择A型ODN。C型CpG ODN的作用则结合了两者的特点, 在肿瘤和感染性疾病的治疗中具有更广阔的前景。 　　1.3 根据其免疫刺激活性进行分类 根据CpG ODN免疫作用的方向可将分为两型: 一型是免疫刺激性CpG ODN (immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides, CpGS ODN), 另一型是抑制性CpG ODN, 包括中和性CpG ODN（neutralizing CpG oligonucleotides, CpGN ODN）［7］和含有CGGG序列的抑制性ODN［8］。抑制性ODN能够拮抗CpGS ODN的作用。上述研究结果