CXCL12促进人胃癌AGS细胞体外侵袭及其机制探究.doc

CXCL12促进人胃癌AGS细胞体外侵袭及其机制探究 　【摘要】 目的 研究趋化因子CXCL12 对人胃癌AGS 细胞侵袭性的影响。方法 在体外用不同浓度CXCL12 处理AGS 细胞后，应用Transwell侵袭实验、RTPCR、明胶酶谱分析法、ELISA法，观察CXCL12对肿瘤体外侵袭能力及金属基质蛋白酶MMP9活性和VEGF表达的影响。结果 CXCL12作用后，人胃癌AGS细胞侵袭能力明显增强，并具一定的量效关系；金属基质蛋白酶MMP9活性呈剂量依赖性增强，VEGF的分泌增加。结论 CXCL12在体外可增加人胃癌AGS 细胞的体外侵袭性。 【关键词】 趋化因子；CXCL12；胃癌；胃黏膜上皮细胞；金属基质蛋白酶9 ABSTRACT：Objective To study the effects of CXCL12 on the invasion of the human gastric carcinoma cell (AGS cell). Methods AGS cells were pretreated with different concentrations of CXCL12 in vitro, and cell migration assay, RTPCR, zymography and ELISA were used to observed the effects of CXCL12 on motility, invasion and MMP9 activity and mRNA expression of AGS cells. Results CXCL12 could increase invasion ability of AGS cell in vitro. The activity of MMP9 was increased in a dosedependent manner. The mRNA expression of MMP9 of pretreated AGS cells was upregulated. Conclusion CXCL12 could increase invasion ability of human gastric carcinoma cells in vitro. KEY WORDS：Chemokine;CXCL12;Gastric cancer;AGS cells；MMP9 肿瘤的侵袭是肿瘤转移的重要环节，是肿瘤细胞粘附、酶降解基质、移动、基质内增殖等一系列过程的表现[1]。本研究体外观察了趋化因子CXCL12对肿瘤体外基质金属蛋白酶MMP9活性以及VEGF表达的影响，以探讨CXCL12促进胃癌细胞侵袭转移的作用机制。 1 材料和方法 1．1 实验材料 CXCL12购自美国Sigma公司；胰蛋白酶和DMEM培养基(高糖)购自Gibco公司(USA)；胎牛血清购自杭州四季青公司(CHINA)；Trizol Reagent购自TaKaRa公司(JAPAN)；MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)、dNTP混合物购自Promega公司(USA)；引物序列由上海Invitrogen公司(USA)合成；Transwell侵袭小室购自Costar公司(USA)；人工基质胶(Matrigel)购自BD公司(SPAIN)。 1．2 实验方法 1．2．1 细胞培养 人胃癌AGS细胞购自武汉大学细胞典藏中心(CTCC)。AGS细胞贴壁培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基，37°C、5%CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期细胞进行实验。按如下分组进行实验：空白对照组、50ng/mlCXCL12组和100ng/mlCXCL12组，每组设置3个平行孔。 1．2．2 Transwell侵袭小室检测细胞侵袭能力的变化 侵袭能力的测定采用Transwell侵袭小室：Matrigel胶(30μg/孔)包被聚碳酸酯膜(8μm孔径)内表面，以此膜分隔上、下小室。无血清DMEM调整细胞浓度为1×106/ml，在上室中加入100μl细胞悬液，在下室中加入600μl含不同浓度CXCL12的无血清培养液，然后在37°C的培养箱中孵育48h，取出滤膜，用4%的多聚甲醛固定，棉签擦去滤膜上未贴壁的细胞，甲醛固定5min，HE染色。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。 1．2．3 RNA提取和逆转录聚合酶链反应(RTPCR) RNA提取参照RNA Trizol提取试剂盒的操作说明书进