利用siRNA抑制环氧合酶2对人胃癌裸鼠移植瘤影响.docVIP

利用siRNA抑制环氧合酶2对人胃癌裸鼠移植瘤影响 　 作者：黄国民 林瑞新 房学东 刘斌 【摘要】 目的 观察环氧合酶2（COX2）对人胃癌裸鼠移植瘤的影响并探讨其机制。方法 构建靶向COX2表达质粒和在BALB/c裸鼠皮下建立SGC7901人胃癌细胞动物模型，用COX2表达质粒基因转染治疗。结果 构建的COX2表达质粒在体内、外均可稳定表达。COX2基因治疗可抑制裸鼠皮下肿瘤的生长和淋巴管的生成。COX2基因转染下调血管内皮生长因子C（VEGFC）的表达。结论 通过构建靶向COX2 siRNA真核表达载体可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长和淋巴管生成，COX2对抑制胃癌细胞（SGC7901）治疗有确切效果。 【关键词】 胃肿瘤;环氧合酶2;基因治疗 目前对于胃癌的治疗效果仍不理想，作为中晚胃癌主要治疗手段的化疗和放疗，在杀灭肿瘤细胞的同时，也损伤正常的组织细胞，疗效低、毒副作用大。有研究表明环氧合酶2（COX2）在多种肿瘤中呈高表达，并可能在肿瘤的发生、发展过程中起到重要的作用〔1，2〕。但由于COX2抑制剂尚存在特异性和抑制效率等方面的不足，因此需要研究如何提高COX2治疗的敏感性。本研究希望通过构建表达靶向COX2的短发夹状双链RNA（shRNA）的表达质粒，转染人胃癌细胞系SGC7901，探讨其抑制肿瘤细胞生长的机制及对淋巴管生成的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物及试剂 　　BALB/c裸鼠，4 w龄，雄性，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。置于SPF级无菌饲养室，恒温，恒湿，半屏障系统下饲养。中分化人胃癌细胞系SGC7901购于中科院上海生物研究所，COX2羊抗人多克隆一抗购于Santa Cruz公司，羊抗人血管内皮生长因子（VEGF）C单克隆抗体、血管内皮生长因子受体（VEGFR）3单克隆抗体购于武汉博士德生物技术开发公司，GENE GENIUS凝胶图像分析仪购于英国Syngene公司。 　　1.2 COX2表达载体的构建 　　全长小鼠COX2的cDNA来自COX2质粒，被克隆至pGenesil1构建COX2表达载体（pGenesil1COX2）。DNA序列分析证实基因序列嵌入适当的读码框内，无突变。由上海博亚生物技术有限公司合成。 　　1.3 RTPCR检测SGC7901细胞COX2 mRNA表达 　　根据GenBank公布的COX2 cDNA序列，利用primer 5软件设计引物。以βactin为内参照。由上海博亚生物技术有限公司合成。COX2引物:上游:5′TCAAGTCCCTGAGCATCIAC3′，下游:5′CATTCCTACCACCAGCAACC3′。目的片段长度488 bp。βactin引物:上游:5′GAAACTACCTTCAACTCCATC3′，下游:5′CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC3′，目的片段长度219 bP。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳嗅化乙锭染色，紫外灯下检查，计算机扫描电泳图像，测出各条带的灰度值。 　　1.4 动物模型及分组 　　实验动物分为3组，每组5只，分别为:接种pGenesil1COX2siRNA质粒组、接种pGenesil1cotrolsiRNA质粒对照组、接种SGC7901组。计数为1×107的细胞接种于裸鼠右前肢腋下，3组细胞接种裸鼠后第4天可见肿瘤长出，每隔4 d测量1次裸鼠最长径a值和最短径b值，4 w后处死，计算肿瘤体积，公式为:肿瘤体积(V)=1/2×最大直径×最小直径2。肿瘤体积抑制率=(1-干预组肿瘤体积/空白对照组肿瘤体积)×100%。共测量7次。 　　1.5 裸鼠肿瘤组织免疫组化染色判断标准 　　COX2、VEGFC阳性细胞为细胞质染色呈棕或棕褐黄色，计算每例切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率，＜10%判定为阴性（-），＞10%判定为阳性（+）。VEGFR3染色呈棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均计为1个微淋巴管（MLV），每例首先在低倍镜下选择微淋巴管密度(MLVD)最高的肿瘤区域，在200倍光镜下，随机计数5个视野内MLV，再求其平均值。通过MLV计数反映VEGFR3水平。 　　1.6 RTPCR检测肿瘤组织COX2 mRNA水平 　　采用Invitrogen公司的Trizol试剂提取肿瘤组织的总RNA,Toyobo公司的RTPCR一步法试剂盒。COX2引物，上游：5′GTCAAAACCGAGGTGTATGT3′；下游：5′AAGTTGGTGGACTGTCAATC3′；扩增产物长度为270 bp。扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳30 min，EB染色，用BIORAD分析仪上观察并记录结果