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前列腺癌组织中SOD2cDNA克隆及其序列分析 　 作者：王明臣 王好东 张善锋 王红钢 臧明玺 赵国强 【摘要】 目的 构建前列腺癌组织中SOD2的cDNA克隆，并进行序列分析。方法 从人前列腺癌组织细胞中提取总RNA并逆转录成cDNA, PCR扩增 cDNA片段, 将cDNA克隆入载体pGEMT中构建TA克隆, 对阳性克隆进行序列测定分析。结果 在1例前列腺癌组织标本中发现了SOD2基因的两个相连的点突变位点：372nt T→G颠换和373nt G→T颠换。蛋白序列比较分析显示：对应SOD2编码蛋白的第89位氨基酸由亮氨酸变为精氨酸。结论 SOD2基因突变在前列腺癌的发生中可能起重要作用。 【关键词】 锰超氧化物歧化酶；逆转录聚合酶链反应；分子克隆；序列测定 【Abstract】 Objective To construct the cDNA clone of superoxide dismutase 2 (SOD2) in prostate cancer tissues and analyze the sequence. Methods Total RNA was extracted from prostate cancer tissues, and then was reversely transcripted to cDNA. The cDNA of SOD2 gene was amplified with PCR method and inserted into pGEMT vector to construct TA clone, and then the DNA sequence of positive clone was performed. Results Two consecutive mutation sites of SOD2 gene were found in one prostate carcinoma specimen: the transversion of 372nt T→G and 373nt G→T. The comparative analysis of corresponding protein sequence indicated that the leucine at 89 site was replaced by arginine.Conclusions The SOD2 gene mutation may play an important role in the pathogenesis of prostate cancer. 【Key words】 Manganesecontaining superoxide dismutase; RTPCR; Molecular cloning; Sequence analysis 前列腺癌发生的确切分子机制尚未阐明。研究表明, 活性氧(ROS)参与肿瘤的启动和促进过程〔1〕。超氧化物歧化酶2(SOD2)基因编码含锰超氧化物歧化酶 (MnSOD)，是体内主要的超氧阴离子自由基清除剂，保护细胞免受ROS的损伤。近年研究发现, SOD2的基因表达量伴随细胞的癌变过程呈正相关下降, 提示SOD2基因系潜在的新型肿瘤抑制基因〔2，3〕。本研究采用RTPCR技术，构建人前列腺癌组织SOD2基因的cDNA克隆并进行序列测定，期望揭示前列腺癌的发生是否与SOD2基因的突变及异常表达有本质联系。 1 材料与方法 1.1 样本的采集与处理 收集2003年～2005年间7例前列腺癌患者手术后的肿瘤组织样本及20例良性前列腺增生患者的组织样本（样本来源于平顶山煤业集团总医院，郑州大学一、二附院, 河南大学二附院）。所有标本取出后立即放入无RNase的EP管中并放入液氮中保存待测。所有病人术前均未行化疗。 1.2 SOD2引物设计与合成 SOD2扩增上游引物：5′CAACGCGCAGATCATGCAGC3′（130～149）；下游引物：5′GGCCTGTTGTTCCTTGCAGT3′（530～511）。由上海生工公司合成，经PAGE纯化。 1.3 TA克隆通用鉴定引物 SP6：5′CATACGATTTAGGTGACACTATAG3′（2 845～2 867 bp）；T7：5′TAATACGACTCACTATAGGGAGA3′（85～63 bp）。由上海生工公司合成，经PAGE纯化。 1.4 cDNA的合成 应用Qiagen公司总RNA提取试剂盒提取RNA。采用的逆转录反应体系：5×RT缓冲液6 μl，10 mmol/L 4×dNTP 2 μl，通用引物1 μl，RNasin 40 U, AMV 5 U,提取