半重叠式多重引物PCR及基因扫描技术在T细胞淋巴瘤诊断中应用.docVIP

半重叠式多重引物PCR及基因扫描技术在T细胞淋巴瘤诊断中应用 　 作者：金贵善 ，全成旭 ，刘福生 ，柴奇 【摘要】 ［目的］ 探讨半重叠式多重荧光多重引物PCR和基因扫描技术在T细胞淋巴瘤诊断中的应用. ［方法］ 从普通石蜡切片组织标本中提取基因组DNA，用半重叠式多重荧光多重引物PCR扩增，利用DNA测序仪对其产物进行基因扫描分析. ［结果］ 37例T细胞淋巴瘤中27例检测出有克隆性重排;25例B细胞淋巴瘤中2例呈阳性;10例何杰金氏淋巴瘤和7例反应性增生病例均呈阴性. ［结论］ 在T细胞受体γ基因重排克隆性检测中，半重叠式多重荧光多重引物PCR及基因扫描技术具有样本来源便利，灵敏度高，特异性强，耗时短等优点，可作为T细胞淋巴瘤的诊断及鉴别诊断的辅助检测手段. 【关键词】 聚合酶链反应;淋巴瘤，T细胞;受体，抗原，T细胞，γ-δ;基因重排，T淋巴细胞 免疫球蛋白基因和T细胞受体（TCR）基因克隆性重排已成为诊断淋巴系统恶性肿瘤常用的基因 标志，而TCR基因重排检测可辅助诊断T细胞淋巴瘤.由于TCR的γ基因重排可出现在几乎所有的T淋巴细胞及T淋巴细胞瘤，且结构相对简单，故常用于T细胞的克隆性检测 ［1］ .Southern杂交和聚合酶链式反应（PCR）均为重要的克隆性检测手段，其中Southern杂交法虽敏感且有特异性，但由于存在操作繁杂、耗时长及需使用新鲜组织等缺点，故广泛应用被受到限制.本实验采用可覆盖所有TCR-γ链可变区（Vγ）和连接链（Jγ）的多重通用引物，经过半重叠式PCR扩增及基因扫描，给经HE形态学、免疫组织化学和Southern杂交法确诊的淋巴瘤患者石蜡包埋组织标本的TCR-γ基因重排进行了检测，探讨了它在T细胞淋巴瘤诊断中的应用价值. 1 材料与方法 1.1 标本来源及病理分类 79例病理石蜡组织标本取自北京市神经外科研究所病理室，按照WHO1999年标准进行病理分类，其中T细胞淋巴瘤为37例，B细胞淋巴瘤为25例，何杰金氏淋巴瘤为10 例，淋巴组织反应性增生为7例. 1.2 DNA的提取 常规方法提取石蜡标本中的组织DNA，制作4～10μm厚的普通石蜡切片标本，常规脱蜡处理，对照HE染色标本，将适量大小的肿瘤组织用刀片刮下，放入20～50μL裂解液中（10mmol TE buffer，1mmol EDTA），同时加入蛋白酶K使终浓度达到200mg/L，56℃恒温水浴孵育过夜，经94℃，10min灭活处理后，以12000r/min离心2min，上清液用作PCR模板.在重排测定前给所有模板进行β球蛋白的PCR扩增，呈阳性者用于重排检测，阴性者用前述方法重新提取. 1.3 引物选择 采用半巢式多重引物PCR方法对TCR-γ基因的重排进行检测.PCR所采用的通用引物包括覆盖所有可变区家族（V γ Ⅰ～V γ Ⅳ）的4个正向引物和连接链（J γ ）的4个反向引物，引物序列见Table1.第2轮PCR中用V γ Ⅰ/B代替第1轮中的V γ Ⅰ/A，同时在4个正向引物的5′端均标记荧光染料，其中V γ Ⅰ，V γ Ⅳ标记同颜色荧光.用此多重引物扩增V γ Ⅰ～V γ Ⅳ的预期片段大小分别为260，180，160，150bp.因V γ Ⅰ与V γ Ⅳ的片段相差110bp，故虽为同颜色荧光，但并不影响相互区分. 　　1.4 半重叠式多重荧光多重引物PCR 向25μL反应体系中加入模板DNA、多重引物、Ampli Taq Gold聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液.PCR反应条 件:94℃变性5min，扩增温度94℃30s，65℃45s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸7min.第2轮PCR中取1μL第1轮PCR的产物为模板，同时用荧光染料标记的正向引物替代第1轮中的相应引物.取5μL PCR产物在20g/L琼脂糖凝胶中电泳，同时加入PhiX174DNA分子质量标准，对PCR产物进行初步鉴定. 1.5 PCR产物序列测定 为验证本实验中所采用的半巢式多重引物PCR反应的有效性和准确性，取4例经Southern Blot证实有单克隆γ受体重排，并且经多重引物PCR后，其产物在琼脂糖凝胶电泳中片段大小有明显差异的T细胞淋巴瘤DNA样本（Fig1中Lane1，9，11，2的样本），进行基因扫描和基因序列测定.样本的准备:以基因组DNA为模板，用未作荧光标记的多重引物经半重叠式PCR后，取2.5μL PCR产物加入1μL ExoSAP（Amer-sham Biosciences），37℃孵育30min，去除多余的dNTPs和引物，再经80℃，20min灭活处理，用未做标记的正向引物进行DNA序列测定. 1.6 基因扫描 给用荧光引物扩增的PCR产物进行基因扫描，上样总量为5μL，其中含有0.5μL P