华支睾吸虫溶血磷脂酶对大鼠肝星状细胞及卵圆细胞作用.docVIP

华支睾吸虫溶血磷脂酶对大鼠肝星状细胞及卵圆细胞作用 　【摘要】 目的: 观察华支睾吸虫溶血磷脂酶（CslysoPLA）重组蛋白体外对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的作用。方法: 应用免疫荧光方法, 观察CslysoPLA重组蛋白是否可与大鼠肝星状细胞和卵圆细胞膜结合; 应用MTT方法, 测定CslysoPLA重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的促增殖作用; 应用流式细胞术（FCM）检测CslysoPLA重组蛋白对大鼠卵圆细胞细胞周期的影响。结果: CslysoPLA重组蛋白可与大鼠肝星状细胞和卵圆细胞膜结合, MTT方法测定结果表明低浓度重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞有一定促增殖作用(Plt;0.05), 20 mg/L重组蛋白可促进大鼠卵圆细胞进入G2期, 但高浓度重组蛋白可导致大鼠肝星状细胞和卵圆细胞死亡。结论: 低浓度的CslysoPLA重组蛋白在体外可刺激大鼠肝星状细胞和卵圆细胞增殖, 表明CslysoPLA可能是华支睾吸虫导致胆管上皮增生、 腺瘤样病变和肝纤维化的效应分子之一。而高浓度的CslysoPLA重组蛋白可引起肝星状细胞和卵圆细胞死亡, 表明CslysoPLA亦可能是华支睾吸虫引起的化学损伤的毒力因子之一。 【关键词】 华支睾吸虫 溶血磷脂酶 肝星状细胞 卵圆细胞 　　华支睾吸虫病（clonorchiasis）亦称肝吸虫病, 是由华支睾吸虫（Clonorchis sinensis, C. sinensis）感染引起的一种食源性人兽共患寄生虫病。华支睾吸虫成虫寄生于人和其他保虫宿主的肝胆管内, 虫体分泌物或代谢产物的化学性刺激及虫体本身的机械性刺激, 可引起胆管局限性扩张、 胆管上皮细胞增生、 管壁增厚、 管腔狭窄等病理改变, 临床上可诱发胆管炎、 胆囊炎、 胆管肝炎、 肝纤维化甚至肝胆管肿瘤［1］。在感染华支睾吸虫的大鼠模型中, 华支睾吸虫合并化学致癌剂20～25周可以诱发大鼠出现肝细胞癌和胆管癌［2, 3］。其致癌机制可能是: （1）虫体长期寄生在胆管内, 导致胆管上皮细胞增生和脱落, 并易继发细菌感染; （2）虫体代谢产物及成虫死亡降解产物所致的化学刺激; （3）与其他因素协同作用, 如致癌物以及机体本身的营养、 免疫、 遗传等因素导致胆管上皮细胞发育不良［4］。虽然流行病学和动物实验结果均表明华支睾吸虫感染是原发性肝胆管癌的病因, 但还有很多问题尚未清楚, 二者之间的直接因果关系尚未得到证明。目前, 有关华支睾吸虫致病机制的了解多源于流行病学调查和临床观察, 对其致病机制的研究很有限。因此, 对华支睾吸虫的分子致病机制研究, 特别是阐明华支睾吸虫感染引起的肝胆管炎症、 腺瘤样增生和癌变的分子机制对防治华支睾吸虫病意义非常重大。我们通过基因工程方法获得了华支睾吸虫溶血磷脂酶(Lysophospholipase of Clornorchis sinensis, CslysoPLA)重组蛋白, 并用Western blot方法初步证实它存在于华支睾吸虫的分泌/排泄抗原中, 且具有磷脂酶A和溶血磷脂酶的活性［5］。在此基础上, 现对CslysoPLA重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的体外作用进行了分析, 以进一步了解CslysoPLA作为分泌/排泄蛋白, 在虫体致病方面所起的作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 细胞核荧光染料Hoechst 33324为Sigma公司产品; 橙红色荧光标记的抗体（Alexa Fluor 555羊抗大鼠IgG）为Molecular Probes公司产品; MTT为MBCHEM公司产品; 胎牛血清（FCS）为杭州四季青公司产品。大鼠肝卵圆细胞（oval cell）由中山大学病理学教研室薛玲老师惠赠, 实验所用的卵圆细胞为第25～28代。大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）由中山大学动物中心提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 CslysoPLA重组蛋白结合大鼠肝星状细胞膜和卵圆细胞膜的免疫细胞化学实验 将大鼠肝星状细胞和卵圆细胞分别铺于24孔细胞培养板, 37℃培养过夜。用无血清培养液洗涤3次, 加入含50 mL/L牛血清白蛋白（BSA）的无血清培养液, 37℃放置120 min。洗涤后, 加入CslysoPLA重组蛋白, 蛋白终浓度为10 mg/L, 37℃放置120 min。洗涤后, 加入用含10 mL/L BSA的无血清培养液1∶200稀释的一抗（分别为免疫重组蛋白的大鼠血清, 重组蛋白免疫前大鼠的阴性血清［5］）, 37℃放置120 min。再加入橙红色荧光二抗（1∶400稀释）37℃放置30 min。最后加入Hoechst, 置荧光显微镜下观察（激发光分别330～385 nm和530～