Ecoli及Yeast菌体蛋白ELISA定量测定方法建立.docVIP

Ecoli及Yeast菌体蛋白ELISA定量测定方法建立 　【关键词】 ,菌体蛋白；酶联免疫吸附测定；紫外线辐照；葡萄球菌A蛋白；生物素 　　［摘要］ 目的：提高酶联免疫吸附测定（ELISA）方法的灵敏度。方法：将聚苯乙烯微孔板（PS）经过紫外线（UV）辐照后，用葡萄球菌A蛋白（SPA）预包被，再应用生物素链霉亲和素（BSA）反应建立双抗体夹心ELISA。结果：检测低限为1.95 ng/ml,方法的批内变异分别为7.96%和8.63%。结论：为菌体蛋白的测定提供了一种新的方法。 　　［关键词］ 菌体蛋白；酶联免疫吸附测定；紫外线辐照；葡萄球菌A蛋白；生物素链霉亲和素 　　Establishment of ELISA for the Quantitative Detection of Ecoli and Yeast 　　Absract：Objective Improve the detective sensitivity of enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)method.Methods Precoating staphylococcal protein A(SPA)on UVirradiated PS plate,then applying biotinStreptavidin system to establish a kind of sandwich ELISA method.Results The detectable lower limit is 1.95 ng/ml,the within run CV are 7.96% and 8.63%. 　　Key words：Bacterioprotein;ELISA;UAirradiation;SPA;BiotinStreptavidin 　　酶免疫测定（enzyme immunoassay,EIA)是将酶促反应的高效率与免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物种体内各种微生物分子（抗原/或抗体）进行定性或定量分析，广泛应用于生物科学和医学实验诊断领域［1］。大肠杆菌（Ecoli)和酵母菌（Yeast)分别为原核和真核细胞微生物，具有代表性，为了提高对微生物分子检测的灵敏度，我们在改善固相模式的基础上，利用生物素链霉亲和素（BSA）放大系统，建立了检测菌体蛋白的ELISA方法。 　　1　材料与方法 　　1.1　主要试剂与仪器　　　　　　　 　　大肠杆菌（Ecoli)、酵母菌（Yeast)菌体蛋白（浓度均为10 mg/ml),由上海万兴生物制品公司提供；多克隆兔抗Ecoli、兔抗Yeast、山羊抗Ecoli和山羊抗Yeast、辣根过氧化物酶标记的羊抗Ecoli(HRPGAEcoli)和羊抗Yeast(HRPGAYeast)由南京军区南京总医院提供；生物素N羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）由美国Sigma公司生产，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（StreptavidinHRP)(编号BA 1088）购自博士德生物工程有限公司，葡萄球菌A蛋白（SPA）购自上海生物制品研究所，其他所用化学试剂均为国产分析纯。BIORAD Model 550酶标仪。 　　1.2　山羊抗EColi和山羊抗Yeast IgG组分的纯化　　　　　　　 　　采用50%饱和硫酸铵盐析法提取［2］，生理盐水溶解后用pH 7.4 0.01 mol/L磷酸盐（PBS）缓冲液透析，定蛋白量备用。 　　1.3　生物素标记山羊抗Ecoli和山羊抗Yeast［3］　　　　　　　 　　将上述纯化的山羊抗Ecoli 和山羊抗Yeast用pH 8.8 0.1 mol/L硼酸缓冲液透析，用无水DMSO配制10 mg/ml生物素N羟基琥珀酰亚胺酯溶液，按照75 μg/ml的氯化铵（用pH7.4 0.01 mol/LPBS配制），室温孵育10 min，完毕后用PBS透析，并加入适量的中性甘油于-20 ℃低温冷冻保存，其工作浓度用方阵滴定法进行确定。 　　1．4　Ecoli和Yeast菌体蛋白检测实验条件　　　　　　　 　　包被液：pH 9．6 0．05 mol／L碳酸盐缓冲液；洗涤液：pH 7．4 0．01 mol／L PBSTween20；稀释液：10％小牛血清(用pH 7．4 0．01 mol／LPBS配制)。用方阵滴定法摸索固相分子SPA的最适包被浓度和兔抗Ecoli与兔抗Yeast抗体的最适反应浓度。先用SPA分子预包被，再分别与兔抗Ecoli、兔抗Yeast反应而固相至微孔板表面，采用上述稀释液进行封闭，至此即可用菌体蛋白的测试。具体步骤如下：将一系列标准浓度的菌体蛋白分别加入到包被好的微孔板内，每孔100 μl，于37 ℃反应1 h，洗涤，空干后分别加入其相应的生物素标记山羊抗