Thanatin突变体在大肠杆菌中表达及纯化.doc

Thanatin突变体在大肠杆菌中表达及纯化 　;作者：顾林，文良柱，吴国球，徐寒梅，沈子龙 【摘要】; 目的:在大肠杆菌中克隆表达thanatin突变体（Th?T）蛋白并纯化。 方法:PCR合成Th?T基因并克隆到pET32a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建Th?T原核表达载体（pET32a?Th?T）并转化到大肠杆菌BL21融合表达，通过正交实验优化表达条件，His?Bind介质纯化。考察经酶切纯化后的重组Th?T对4种供试菌的最低抑制浓度。结果:菌体在LB培养基（pH 6?5）培养4.5 h，IPTG 0.4 mmol·L－1诱导7 h，Th?T融合蛋白大量可溶性表达，经药敏试验证明纯化的重组Th?T具有预期的抗菌活性。结论:本研究为通过大肠杆菌体系表达重组Th?T抗菌药物奠定了基础。 【关键词】; thanatin；突变体；大肠杆菌；融合蛋白；纯化；表达；药敏试验 　Thanatin是在昆虫斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）中发现的，由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽，对革兰阳性、阴性菌以及某些真菌均有抑制作用，而且对一些临床上的耐药菌也有良好的抗菌活性[1]。Lee等[2]研究了thanatin的各种突变体，发现将其结构中第15位的苏氨酸残基删除后，对革兰阳性菌的抑制效果增强，而对革兰阴性菌和真菌的最小抑菌浓度不变，其二级结构仍保持thanatin原有的结构，即N末端7个氨基酸臂和C末端的14个氨基酸组成的beta;片层结构,通过抑制细胞呼吸达到抗菌的效果[3]。目前国内外对thanatin已有深入的研究[4?5]，而对具有更佳抗菌效果的突变体相关研究却比较少。本研究旨在将人工合成的thanatin突变体（Th?T）基因克隆到pET32a融合表达载体中，通过正交设计考察培养基pH值、诱导剂用量及诱导时间与融合蛋白表达水平的关系，使融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效可溶性表达，纯化融合蛋白并经凝血酶切割，考察纯化的重组Th?T作为抗菌药物的应用价值。 　　1; 材料与方法 　　1.1; 菌种和载体大肠杆菌菌株BL21(DE3)和pET32a载体由第一作者所在实验室保存，标准菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌由中国药科大学微生物学教研室提供。 　　1.2; 酶和试剂限制性内切酶、Taq酶、dNTPs、DNA marker、异丙基硫代?beta;?D半乳糖苷（IPTG）为MBI产品，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，丙烯酰胺、亚甲基双丙烯胺及Tris碱为BBI产品，低分子质量蛋白质标准品为Promega公司产品；His?Bind Resin为Novagen公司产品，Thrombin及其10倍缓冲液为Sigma公司产品，结合缓冲液、洗涤缓冲液及洗脱缓冲液按Novagen His?Bind Resin 试剂盒配制，其余试剂为进口分装产品。 　　1.2; 方法 　　1.2.1; Th?T基因的合成与表达载体pET32a?Th?T制备及转化 　　1.2.1.1; Th?T基因的合成; 根据Th?T基因的氨基酸序列GSKKPVPIIYCNRR GKCQRM和大肠杆菌的偏爱密码子逆推出突变体的cDNA序列，并设计出PCR的引物。引物1：CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACT TACCCCTACGGTTAC AGTAGATTATC;引物2：GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAG CCTGTC CCGATAATCAACTGTAAC。单下划线序列为限制性内切酶切位点，双下划线为编码凝血酶酶切位点的序列。引物1和2互为模板，PCR扩增基因。PCR反应体系（50mu;l）：引物浓度2mu;mol·L-1，dNTPs 40mu;mol·L-1，MgCl2 1mu;mol·L-1，Taq酶0.5 U，PCR反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7min。 　　1.2.1.2; 表达载体pET32a?Th?T构建; PCR产物经纯化后用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切得到的片断由BamHⅠ和XhoⅠ位点克隆到载体pET32a，转化到大肠杆菌BL21菌株，涂布含氨苄青霉素100mg·L-1的LB平板，37℃培养过夜，挑选克隆培养提取质粒，BamHⅠ和XhoⅠ单酶切验证，进一步测序确定（由上海生工生物工程有限公司完成）。 　　1.2.2; 融合蛋白可溶性表达的条件优化; 将测序正确的阳性菌株转入含氨苄青霉素100mg·L-1的LB培养液，37℃培养过夜。挑选1个单克隆菌落，转入含氨苄青霉素100mu;g·ml-1的LB培养液，37℃培养过夜作为种子液，取适量菌液。按1％的接种量放大培养，