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免疫沉淀法分离血清APOB在慢性丙型肝炎及脂代谢探究中应用 　 作者：李泽孟，蒋文英，张劲，魏荣，朱建宏，杨璐，焦娇 【摘要】 目的：为研究西安地区慢性丙型肝炎(HCV)感染与脂代谢关系而探讨脂质简便分离技术的可行性。 方法：以羊抗人APOB抗血清沉淀并分离HCV抗体阳性者血清APOB，再以PCR技术进行扩增检测APOB中HCVRNA，并作血清HCVRNA检测及HCV抗体阴性组对照。结果：在HCV抗体阳性者血清APOB实验组中，检出了HCVRNA，且拷贝数占血清中HCVRNA的较大比率(4.74% ~ 27%)，而各对照组中没有HCVRNA表达。结论：免疫沉淀法分离血清APOB的实验方法是一项传统的成熟技术，操作方便稳定可靠，实验结果进一步支持和证实了HCV与LDL结合的密切关系。 【关键词】 免疫沉淀法；羊抗人APOB血清；聚合酶链反应PCR技术；HCVRNA；脂质代谢 　　近年来，HCV感染慢性化后肝脂肪变性的问题在临床普遍予以重视。因此，医学界人士对HCV感染与脂肪代谢的关系进行了很多的研究。国外学者Thomssen 等人［1］用梯度离心法和免疫沉淀法发现HCV－RNA与LDL结合的组分可被抗β脂蛋白抗体共同沉淀。Prince等［2］注意到了高度感染性血清中的HCV与LDL的结合具有特殊的亲和力，利用柱层析技术将含有HCV的血清进行分离后，以PCR技术进行扩增检测得到证实。为探讨西安地区慢性丙型肝炎（以下简称丙肝）患者HCV感染与脂类代谢的关系及特点，笔者选用免疫沉淀技术，用羊抗人APOB血清从HCV抗体阳性者血清中分离获得载脂蛋白B（APOB），再以逆转录聚合酶链反应（RT PCR）技术进行扩增检测HCVRNA，并与对照组比较分析，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 用于沉淀慢性丙肝患者血清APO的羊抗人APOB抗血清及pH 7.5磷酸盐缓冲液，由上海科华生物科技公司提供，其质量检验应用日立7170 A全自动生化仪；HCVRNA检测试剂由广州达安生物科技公司提供；PCR仪为美国PE 5700型实时荧光定量分析仪；实验用HCV抗体阳性血清来自本院门诊和住院确诊病例的自愿者；对照组用慢性乙型肝炎患者血清（HBV1.4.5项阳性）来自本院门诊的确诊病例。均于晨空腹抽血备用。 　　1.2 方法 　　1.2.1 羊抗人APOB抗血清重现性、准确性、线性检测 用无溶血、无黄疸、无脂血的新鲜血清样品，作APOB测定20次，计算各均数及变异系数，结果：X(8/L)0.71、1.12；S(8/L)0.02、0.03；CV(8/L)2.82、2.68。另以科华公司的APOB定标液制定标准曲线后，分别测定Precinoim和Precipath 3次取其均数，与定标、测定值比较，结果：标定值0.95、1.59；测定值0.92(97.3%)、1.46(91.8%)，准确性偏差lt;10%。线性检测参照Albers等所述的方法进行，取APOB量较高的样品，分别按照各测定条件，取得各自测定值，再作不同比例稀释（30％～90％），原测定值与稀释比例的乘积为预期值，从低浓度到高浓度反复连测3次，分别计算每一浓度测定值均数，再与预期值作比较。结果本批次羊抗人APOB血清的回归方程Y=0.989X±0.052，r=1.000，线性范围为0.25 g/L～2.00 g/L。 　　1.2.2 HCV抗体阳性血清中APOB的分离提取 取实验血清15 μl加磷酸盐缓冲液1.5 ml，置37 ℃孵育5 min再加入羊抗人APOB 0.5 ml混匀，37 ℃孵育5 min制成APOB悬液。以8 000 r/min高速低温离心15 min，去上清液，留取沉淀0.5 ml（APOB），用于HCVRNA检测。 　　　1.2.3 APOB中RNA的提取 于灭菌处理过的0.5 ml离心管中先加入10 μl RNA提取液A，然后加入上述提取物apoB 100 μl，再加入200 μl的RNA提取液B，混匀，量室温5 min，8 000 r/min离心1 min，去上清后，用75%预冷乙醇，洗沉淀两次，65 ℃干燥沉淀10 min。 　　1.2.4 逆转录、PCR扩增及反应前、后荧光检测 严格按操作流程、步骤和试剂使用说明书进行上述样本的实验，并详细记录读数A1。 　　2 结果 　　HCV抗体阳性血清APOB中及对照组中HCVRNA检出情况，见表1。 　　表1 HCV抗体阳性血清APOB及对照组中HCVRNA检出情况（略） 　　3 讨论 　　免疫沉淀法是一项传统的成熟试验技术，对于抗血清的制备其质量要求较高，尤其对微量实验，要求在同一批号内的效价与亲和力要高，特异性与稳定性要好，方能保证实验的稳