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大鼠肠巨噬细胞肠上皮细胞分泌TNFa规律及药物作用探究
大鼠肠巨噬细胞肠上皮细胞分泌TNFa规律及药物作用探究
作者:温志新,王辉,陈海龙,范琦,李文利
【摘要】 目的:本实验利用体外单独培养的肠巨噬细胞、肠上皮细胞及二者混合细胞,通过脂多糖(LPS)刺激及地塞米松(DEX)、TNFa单克隆抗体及复方清下汤作用,探讨肠巨噬细胞、肠上皮细胞的TNFa分泌及以上三种药物的影响。方法:体外培养肠巨噬细胞、肠上皮细胞及二者混合细胞,三种细胞除对照组外,都用LPS诱导,同时一部分细胞再经DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤分别处理,培养6 h后取上清液。应用放免法检测TNFa。结果:正常肠巨噬细胞可分泌少量的TNFa。LPS诱导组分泌显著增加,DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤处理组与脂多糖诱导组相比分泌显著降低。正常肠上皮细胞可分泌少量的TNFa,但LPS诱导组与正常对照组及药物处理组与LPS诱导组之间差异无显著性。混合细胞结果与肠巨噬细胞相同。结论:肠道屏障受破坏时,门静脉血中TNFa明显增高,这主要与肠巨噬细胞在内毒素刺激下分泌增多有关,与肠上皮细胞无明显关系。DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤均可抑制肠巨噬细胞分泌这三种物质。DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤具有肠黏膜屏障的保护作用。
【关键词】 肠巨噬细胞;肠上皮细胞;肿瘤坏死因子;肠道屏障
TNFa是一个具有157个氨基酸的蛋白,是机体的早期炎性介质,在炎性介子连锁反应中起重要作用。本实验利用体外单独培养的肠巨噬细胞、单独肠上皮细胞及二者混合的细胞,通过脂多糖(LPS)刺激及地塞米松(DEX)、TNFa单克隆抗体及复方清下汤作用探讨肠巨噬细胞及肠上皮细胞TNFa的分泌及以上三种药物的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 1SD雄性健康大鼠,220 g~250 g。由大连医科大学实验动物中心提供。DMEM培养基、RPMI 1640培养基(GIBCO公司)、等渗细胞分离液(Percoll solution由1份10xDulbecco’s磷酸盐缓冲生理盐水和9份细胞分离液构成。不同浓度的Percoll溶液用1xDulbecco’s磷酸盐缓冲生理盐水稀释)、胶原酶IV(Collagenase Iv SIGMA公司)、大鼠TNFa放免检测试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所)、NO检测试剂盒(北京晶美生物公司)。中药:复方清下汤,由大黄、芒硝、枳实、川朴等10位中药组成,经抽提、过滤制成精制药液。
1.2 方法
1.2.1 组织制备 肠上皮细胞分离[1]:动物以密闭CO2笼处死,迅速取全肠,用50 ml冷PBS(pH=7.4)冲洗肠腔。纵向剖开,置入含0.1%EDTA的无钙、镁Hanks平衡盐溶液中,37 ℃水浴中振荡20 min后,收集上清,用于分离肠上皮细胞;肠巨噬细胞的分离[1]:所取组织继续以HBSS/EDTA消化40 min,然后用5%胶原酶Ⅳ的含钙、镁的Hanks液继续振荡消化2 h。所得细胞悬液以53 μm尼龙网过滤得单个细胞;分离肠上皮细胞:第一次EDTA处理的细胞悬液以HBSS洗2遍,悬于40%等渗的细胞分离液中。1 500 rpm离心,4 ℃,15 min。收集上层细胞(含有98%肠上皮细胞),用HBSS洗3遍,以DMEM调细胞浓度为4×105/ml。用胎盘蓝染色,细胞活力为80%。以碱性磷酸酶标记的单克隆抗体进行细胞染色,肠上皮细胞纯度为98%(染色阳性的为肠巨噬细胞)。分离肠巨噬细胞:经胶原酶处理的细胞悬液,以HBSS洗涤。悬于50%等渗的细胞分离液后,离心,2 000 rpm,4 ℃,15 min。收集细胞沉淀,以无钙、镁的HBSS洗3遍,RPMI 1640培养基调细胞浓度为4×105/ml。
1.2.2 实验分组 肠巨噬细胞组:取24孔培养板,每孔加入肠巨噬细胞悬液0.5 ml及DMEM培养基0.5 ml,取三孔作正常对照,其余各取三孔分别加入40 μl LPS终浓度(10 ug/ml),20 μl (LPS终浓度为10 ug/ml)及20 μl DEX(终浓度为106 mmol/l),20 μl LPS(终浓度10 ug/ml)及20 μl TNFa单克隆抗体(终浓度101 mmol/l),20 μl LPS(终浓度10 ug/ml)及20 μl复方清下汤(终浓度1∶100)。对照组加40 μl生理盐水;肠上皮细胞组:24孔培养板,每孔加入肠上皮细胞悬液0.5 ml及PRMI 1640培养基0.5 ml。取三孔作为正常对照,其余各取三孔分别加入40 μl LPS(终浓度10 ug/ml),20 μl LPS(终浓度10 ug/ml)及20 μl DEX(终浓度106 mmol/l),20 μl LPS(终浓度10 ug/ml)及20 μl复方清下汤(终浓度1
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