第三章细胞生物学研究方法2.pptVIP

Atomic Force Microscopy Germinating Spore 红色：5号，绿色：16号，紫色：17号,黄色：22号， 长臂猿6号标上5和16号，18号标上5号，13、16显示17号 人类13号与猫科杂交，A1的远端 人的端粒特异YAC克隆（7q)与黑猩猩的杂交 人的1号染色体与长臂猿杂交结果 2. Southern杂交　　是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到尼龙膜或其他的膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，及可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 Southern 杂交 Nouthern 3. PCR技术 　　聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）用于将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。其过程是：①合成一对寡核苷酸链（约18—20个核苷酸长）为引物（primer），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区的区域；②将DNA片段样品溶解于反应缓冲液中，加入4种dNTP和一种耐高温的DNA聚合酶；③变性：将反应液置于PCR仪中，提高温度（约94℃）使DNA的两股链解离。退火：立即下降温度至37℃，使之以解离的单链为模板，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成了DNA双链片段； ④延伸：再次上升温度至70-75℃，再次降温，重复前一步骤的变化。如此反复升降温若干次，每一次解链和合成互补链为一个循环。为了使DNA片段扩增到所需的量，大约要进行20—30次循环。　　用于PCR反映的DNA聚合酶是从一种嗜热水生菌（Thermus aquaticus）中分离出来的，命名为Tag DNA聚合酶。此酶最适作用温度为75~80℃，但短时间在95℃下仍能不失活。 DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。 预变性(92-95?C,2-5m) 变性(92-95?C,30s) 退火 (40-60?C,30s) 延伸(72?C,30-60s) 总延伸(72?C,7m) (25-35) PCR的一般过程： 经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 240 16 256 ７ 114 52 22 8 2 0 0 短片段（单链） 14 12 10 8 6 4 2 长片段（单链） 128 64 32 16 ８ ４ ２ 总片段（单链） ６ ５ ４ ３ ２ １ ０ 循环数 4. 生物芯片技术 生物芯片技术是随着“人类基因组计划”的进展而发展起来的，它是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，它融微电子学、生物学、医学、化学、物理学和计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。 * （七）冷冻-蚀刻电镜技术 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100℃的干冰或-196℃的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面的结构。冰升华暴露出标本内部结构的步骤称为蚀刻（etching）。蚀刻后，再向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 其样品制备要经过五大步骤。 　　 1、冷冻：用快速低温冷冻法将样品迅速冷冻，使样品固定。 2、断裂：在低温下用刀将样品进行断裂。这时样品往往从其结构相对“脆弱”的部位（即膜质双分子层的疏水端）断裂。从而显示出镶嵌在膜质中的蛋白质颗粒。 3、蚀刻、由于绝大部分生物样品都含水分，样品冷冻断裂后，在低于水的饱和蒸汽压的真空下，断裂面的冰在真空中少量升华，可进一步增强“浮雕”式的蚀刻效果。使断裂面原有的三维结构更明显。 4、复型：将样品断裂面上暴露出的微细结构用一金属膜复制下来的过程称复型。一般用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差，再经碳垂直于断面进行真空喷镀，形成一个连续的碳膜， 5、剥膜：要得到复型膜需用消化液把样品本身消化掉，剩下的碳膜及其构成图形的金属微粒移导载网上进行电镜观察。 样品 氟利昂 液氮 样品 样品台 钟罩 冰刀 样品 刀口 断裂 蚀刻 喷镀和复型 电镜下观察复型 冷冻蚀刻技术从描述方法和图像解释上都开辟了新思路。细胞经低温冷冻断裂时所形成的不是切面，而是断裂面，这一断裂面不是沿着刀缘前进的方向，而是沿着结构上脆弱的途径进行的。由于构成膜的脂质双分子层的疏水键结合力弱，所以断裂易沿着膜的内部进行，因此冷冻蚀刻技术不仅有利于研究细胞结构的立体