目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定生物化学与分子生物学.pptVIP

模板序列：待扩增的DNA序列，一般为双链的DNA可包括线形双螺旋DNA，如基因组DNA，及闭环双链DNA，如质粒； 模板的来源很广，如从细胞/细菌中提取基因组DNA、提取mRNA经反转录得到cDNA、质粒、病毒等； 每个反应中模板的量为1 ng～1 μg。质粒DNA和纯化的DNA的量可少一些，而基因组DNA的量应多一些。 PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致PCR的非特异性扩增。 1、模板DNA 引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为5′端引物和3’端引物，或称为正向引物和反向引物。 通常DNA及mRNA序列的写法为5′→3′，所以5′端引物与目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物与目的序列的3′末端序列反向互补。 2、引物 它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。 为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有15～18 bp。 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 上游引物 下游引物 DNA聚合酶：以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNA的一种酶。 早期的PCR反应使用的DNA聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但该酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。 随着新的耐热DNA聚合酶的发现及在PCR反应中的应用，使PCR操作更方便，产量更稳定。 目前商品化的DNA聚合酶有Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶最适工作温度为75-80℃。该酶具有5′→3′聚合酶活性，在镁离子存在情况下可催化核苷酸沿5′→3′方向发生聚合反应。 3、DNA聚合酶 4、脱氧核糖核酸 四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，为PCR反应中DNA合成原料。 在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。 缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有KCl、Tris-Cl和MgCl2。 其中Mg2＋的浓度最重要，它能影响DNA聚合酶的活性，以及模板与PCR产物的解链温度。 5、缓冲液 变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的DNA分子；在应用Taq DNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94℃～95℃条件下进行。这也是Taq DNA聚合酶进行30个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。 退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低5～10℃，PCR实验要对退火温度进行优化。 二、PCR基本步骤 延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的3′端，使引物沿5′→3′方向生成与模版DNA互补的新DNA链。 双链模版DNA 变性 退火 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 上游引物 下游引物 延伸 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 多次循环 （2n 拷贝） 下面为一个典型的PCR循环参数设置： 备注：* 比两条引物的Tm值低5~10℃。 94℃ 5 min 94℃ 30 s X ℃* 30 s 72℃ 1 kb/min 72℃ 5 min 25-35个循环 三、影响PCR因素 虽然PCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响PCR的特异性和高效性。 引物 变性温度和时间 退火温度和时间 延伸温度和时间 循环次数 引物决定了PCR产物的长度和特异性。 引物的设计要求请看本实验讲义“引物设计”部分。 1、引物 在PCR反应刚开始时，为保证作为模板的双链DNA完全变性成单链DNA，一般设为95℃、5 min；在随后的循环中，可设为95℃、30s。 有些模板DNA的G+C含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间会影响DNA聚合酶的活性。 2、变性温度和时间 退火温度与引物的Tm值相关，一般比Tm值低5~10℃。 退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合而降低PCR效率。 在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间设置为30s基本上就足够了。 3、退火温度和时间 * 目的基因的PCR扩增 及其扩增产物的鉴定分析 综合性设计性实验-8 此实验共包括如下六个部分 第一部分，目的基因选择 第二部分，PCR引物设计 第三部分，PCR实验操