谷子铜离子转运蛋白的克隆.doc

谷子铜离子转运蛋白的克隆 1、相关定义 1.1、单克隆抗体的基本概念 抗体主要是由B淋巴细胞分泌的,每个B淋巴细胞具有合成一种抗体的遗传基因。动物 脾脏内有上百万种不同的B淋巴细胞系,可以分泌很多不同的抗体。抗原分子上有很多的抗 原决定簇可以刺激不同的B淋巴细胞进行分裂增殖形成多克隆,并合成多克隆抗体。如果能 从中挑选出其中的一个B淋巴细胞进行培养,就可得到由单细胞分裂增殖形成的细胞群,即 单克隆。单克隆细胞将合成一种抗原决定簇的抗体,称为单克隆抗体。 1.2、热激蛋白的定义 热激蛋白(HSP)是细胞在一些诸如热休克、水分亏缺、重金属污染等胁迫条件下 高效表达的一大类蛋白。根据对昆虫、鸟类、鱼类、哺乳类、植物以及细菌、酵母等多 种生物的研究发现, 热应激是生物体遭受胁迫时正常蛋白的合成受阻,HSP 合成的一系 列过程[4]。 1.3、蛋白激酶的定义 蛋白激酶又称蛋白质磷酸化酶(protein phosphakinase)。一类催化蛋白质磷酸化 反应的酶。它能把腺苷三磷酸(ATP)上的 γ-磷酸转移到蛋白质分子的氨基酸残基上 [15]。蛋白激酶它是一类在蛋白质磷酸化过程中起中介和放大作用并帮助完成信号 传递过程的酶。蛋白激酶负责将磷酸基团转移到特定底物蛋白上,这类酶用 ATP 或 GTP 作为磷酸基团的供体,以蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸作为磷酸基 团的受体[16]。 1.4、caspase 家族的定义及分类 到目前为止,在哺乳动物中已被证实的 caspase 家族的成员共有 15 种,按发现的先后顺序可将 其命名为 caspase 1~caspase 15。人类中已发现了 11 种[30],为 caspase 1~10, 13;caspase 11, 12 和 14 是在小鼠中发现的, 其中 caspase 11,12 仅存于小鼠中并具种属特异性。Eckhart[31]等(2005) 在猪,狗 和牛中新发现了 caspase 15,由于人类和小鼠中缺乏这种酶,因此其属于该家族中的一个变异分子。 caspase 为半胱氨酸蛋白酶家族中的一员,具有天冬氨酸(Asp)底物专一性的特征,是动物 PCD 过 程的关键调控因子。caspase 的激活过程主要包括:1.切下羧基端的小亚基 2.N 端的 prodomain 与大 亚基分离 3.大亚基和小亚基聚合成一个具有活性的四聚体(两个小亚基在中间,两个大亚基位于外 周),形成一个具有活性的 caspase 酶(图 1-3)。 注:红色箭头表示蛋白水解位点。红色圆圈表示的催化位点 Note:Red arrows indicate proteolytic sites. Red circle indicates the catalytic sites. 图 1-3 细胞凋亡中 caspases 的激活[32] Fig.1-3 Activation of caspases in apoptosis caspase 家族的第一个成员是 Yuan[33]等(1993 年)在线虫(C . elegans)中发现的,并将其命名为 3 CED-3,研究发现该基因的过表达会引起细胞凋亡的产生,推测其可能与哺乳动物的 ICE 同源。 Mundle[34]等发现 ICE 参与到细胞凋亡的级联反应中。后来有学者将其重新命名为 caspase 1。这是 caspase 家族的第一个成员,结构域分析发现其包含 2 个大亚基和 2 个小亚基,它在细胞凋亡中的作 用并不十分明显,而在炎症反应中起到关键作用[26],主要参与到 IL- 1β的成熟和转运。该家族成员 按功能可分为三类,第一类与炎症相关(inflammatory mediator),包括 caspase 1、4、5 和 11-14;第 二类为启动凋亡(Apoptosis activator),包括 caspase 2、8、9 和 10;第三类为效应凋亡(Apoptosis executioner) ,包括 caspase 3、6 和 7[35]。其中 caspase 15 属于新发现的成员,其具体功能还有待进 一步研究。根据其前体结构域的不同,又可将其分为以下四类,第一类包含两个 DED(death effector domain)结构域,代表成员为 caspase 8 和 10;第二类包含一个 CARD(caspase recruitment domain)结 构域(大于 90 个氨基酸),代表成员是 caspase 2 和 9;第三类也包含一个 CARD 结构域,代表成员 是 caspase 1、4、5 和 13;第四类它们的 N 端前体很短,一般只有 20-30 个氨基酸,代表成员包 括 caspase 3、6 和 9[36]。结合功能