RNA干扰沉默PTTG基因对大鼠垂体瘤细胞增殖与凋亡水平的影响.pdf

山东人学博I：学位论义 MOI时，2#，3#，4#能够达到70％以上的敲减效率，4#是最佳的靶点。比较高低 MOI的数据可以看到，高MOI时，敲减的效果更好，但NC对照组与未感染组的 差异大于低MOI时的差异。 本部分实验成功构建了四组特异性针对rPTTGl的shRNA慢病毒载体，RNAi 慢病毒的包装也同时完成，并在293T细胞中完成病毒包装后的滴度标定。通过 该部分试验，我们成功的从四组重组载体中筛选出高效率的靶点，并明确不同 MOI值得非特异的毒性差异，为下一步选用最高效率的重组载体对垂体瘤细胞 GH3进行转染提供了可靠的依据。 第二部分RNA干扰目的细胞效果测定 通过前一部分试验，我们成功构建出四组特异性针对rPTTG基因的vshRNA 重组载体，并在工具细胞(NRK细胞)中对四组重组载体的转染效率和沉默效果 进行评价，从而成功从中筛选出4#为最佳靶点，因此，在后续试验中，我们采 用4#慢病毒重组载体，在生长状态良好的GH3细胞中进行慢病毒转染，简要介 绍如下： 培养生长状态良好的目的细胞(即GH3细胞)，病毒感染前一天将目的细胞 分入6-well培养板培养，感染当天按实验设计的组别分别加入RNAi慢病毒颗 粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况，感染 5天后收集细胞，采用realtime-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况， 进而判断干扰效果。 试验结果显示，4#vshRNA重组载体能够成功的转染进入垂体瘤细胞GH3中。 Realtime PCR结果显示该重组载体对GH3细胞中pttg基因的表达有显著敲减 白对照组以及非特异病毒对照(NC)组的比较中，我们可以看到在稳定转染5 天以后，4#重组载体转染组的细胞开始出现片状堆积，细胞变性的变化，8天后， 较其它两组对照细胞，4#重组载体转染组出现大面积的细胞凋亡的现象。 第三部分RNA干扰前后细胞生物学行为的变化 在垂体瘤细胞中成功干扰PTTG基因后，PTTG的RNA水平和蛋白水平上都有 了极大幅度的沉默，同时，在肉眼观察下，我们也看到了成片的垂体瘤细胞在 PTTG被沉默后出现了变性，凋亡的现象。为进一步明确在PTTG被沉默后垂体瘤 3 山东人学博I：学位论义 细胞的生物学行为是否出现变化，我们分别采用了MTT办法和流式细胞办法，检 测垂体瘤细胞在PTTG基因沉默自i『后细胞生长周期和凋亡水平的改变，简要介绍 如下： (1)MTT方法检测RNA干扰前后细胞增殖水平变化：培养生长状态良好的 目的细胞(即GH3细胞)，病毒感染前一天将目的细胞分入96-well培养板培养， 感染当天按实验设计的分组情况加入不同干扰(空白对照，无意义对照以及阳性 病毒)进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP／RFP表达情 况，4-5天后进行MTT分析，检测有效RNAi靶点干扰后的垂体瘤细胞增殖水平 变化。 (2)PI染色流式细胞仪检测RNA干扰前后细胞凋亡水平变化：培养生长状 养板培养，感染当天按实验设计的分组情况加入不同干扰(空白对照，无意义对 照以及阳性病毒)进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察 干扰后的垂体瘤细胞凋亡水平变化。 结果： (1)沉默组的细胞生长曲线较其它两组细胞(空白对照组以及NC组)在48h 后开始出现明显的延缓现象，这一结果提示在PTTG被沉默后，垂体瘤细胞的增 殖能力明显减弱，肿瘤细胞的生长能力明显被抑制。 (2)通过PI染色流式细胞方法检测转染沉默前后细胞群体中各时期细胞的 比例，我们发现，与其它两对照组比较，在PTTG被沉默以后，垂体瘤细胞群体 中，凋亡细胞所占的比例大幅度增加。 众多研究表明，多数疾病的发生发展与基因突变及修饰有关，如何特异性进 行致病基因的修复或删除，是目前基因治疗研究领域的热点。RNAi技术被发现 并逐渐阐明以来，该技术日益成为基因治疗研究方向最常被运用的工具。这归功 于该技术具有基因治疗所必需的高特异性和高效性。这些特性也正是以往被运用 于基因治疗研究的其它技术所无法达到的[19]。同时需要提到的是，与很多以往 的基因治疗方式一样，如何使RNAi效果能够稳定长期的在细胞中实现是目前将 RNAi技术运用于疾病基因治疗的难点[20]。