分子生物学常用技术一凝胶电泳.pptVIP

迷你垂直型电泳槽 德厚行远，因尔成道 DNA序列分析电泳槽 德厚行远，因尔成道 中型双垂直电泳槽 德厚行远，因尔成道 蛋白电泳 德厚行远，因尔成道 （三）醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 德厚行远，因尔成道 （四）等电聚焦电泳技术 等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。 现在它经常与SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳构成二维电泳中的第一向，主要用于分离蛋白质。 德厚行远，因尔成道 IEF的基本原理? 在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。 可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。 德厚行远，因尔成道 德厚行远，因尔成道 （五）SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。 德厚行远，因尔成道 （六）IEF/SDS双向电泳法? 1）IEF/SDS双向电泳法是在1975年Farrall 等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异 建立的IEF/SDS双向电泳。其中IEF电泳为 第一向，SDS为第二向。 2）IEF电泳结束后，将圆柱形凝胶在SDS所应用的样品处理液（内含SDS、β-巯基乙醇）中 振荡平衡，然后包埋在SDS的凝胶板上端， 即可进行第二向电泳。 3）IEF/ SDS双向电泳对蛋白质（包括核糖 体蛋白、组蛋白等）的分离是极为精细的，因此特 别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。 德厚行远，因尔成道 蛋白质组分析的首要要求 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。 德厚行远，因尔成道 检测仪器 凝胶成像系统 德厚行远，因尔成道 电 泳 德厚行远，因尔成道 电泳基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 德厚行远，因尔成道 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 德厚行远，因尔成道 二、主要方法 有支持物的电泳技术： 1、纸上电泳 2、醋酸纤维薄膜电泳 3、薄层电泳 4、非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等) 5、凝胶支持体区带电泳 ①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂糖凝胶  德厚行远，因尔成道 不用支持体的电泳技术： 1、Tiselius电泳 2、显微电泳 3、等电点聚焦电泳技术 4、等速电泳技术 5、密度梯度电泳  德厚行远，因尔成道 DNA电泳 德厚行远，因尔成道 DNA分子带负电，向正电方向游泳 德厚行远，因尔成道 （一）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分