健脾理气中药对肝癌及转移影响实验的研究.pdfVIP

材料与方法 I、动物品系:裸小鼠(BALE/C-nu/nu)，雄性，四周龄，体重18士。.8克。 (购于中国科学院上海实验动物研究中心) 2,饲养条件:在恒温 (25-270C)、恒湿 (45-50%)、新鲜空气高度除尘除菌、 无特殊病原体 (SPF)环境下饲养。动物置于有机玻璃饲养盒内，安放在层流式 超净架内，每只饲养盒饲养4只动物，灭菌处理白呀 饲料供动物自由摄入。 3、人肝癌高转移模型制作:将对数期生长的HCCLM3癌细胞培养液田MEM, PAALaboratories,Linz,Austri的丢弃，用无菌中性PBS(Hyclone,Utah,USA)洗涤 细胞一次，用胰酶(PAALaboratories,GmbH,Linz,Austria)消化，从培养瓶(Corning, Incorporated,Corning,NY,USA)洗脱，吹打成单细胞悬液。0.4%TrypanBlue染色 显示活细胞比率在98%以上。调整细胞浓度至5X106/0.2ml的细胞悬液，接种于 裸小鼠右肩脚下皮下。待肿瘤长到直径约I厘米时，用脱椎法处死裸小鼠，取肿 瘤组织，仔细除去表面的纤维包膜，血管。用PBS缓冲液漂洗后放入有DMEM 培养液的培养皿中，切成Inun瘤组织块。用3%的硫酸戊巴比妥钠腹腔注射法 麻醉裸小鼠，剂量40mg/kg。动物固定取仰卧位，皮肤用0.5%碘伏消毒两次， 铺无菌孔巾。取左肋下切口，长1.5厘米，分层切开腹壁进入腹腔，暴露肝脏左 叶。在其表面做0.3厘米切口，压迫止血，将瘤组织块植入肝内，8-0的无损伤 外科缝线8字形缝合肝脏，将肝脏送回腹腔，6-0的无损伤缝线全层缝合腹壁. SPF饲养I].(HCCLM3细胞株由肝癌研究所提供) 4,脾虚模型制作151,(一)药品:(1)大黄芒硝合剂:以生大黄后煎，按剂 量与芒硝之比为4:1制成浓度为含生药I克/毫升的水煎剂。(2)健脾理气汤: 党参、白术、获荃、八月扎等量，甘草按前药单味的1/6剂量，制成每毫升含生 药0.5克的水煎剂。(上述两方由肿瘤医院中药房煎制) (二)方法:以大黄芒硝合剂0.3毫升隔日灌胃。 5、动物分组及用药:所有动物在接种肿瘤第二天后随机分成四组。(1)健 脾组8只，以健脾理气汤0.3毫升每天两次灌胃。(2)脾虚组9只，以大黄芒硝 合剂0.3毫升隔日灌胃，以生理盐水0.3毫升每天两次灌胃。(3)脾虚健脾组8 只，以大黄芒硝合剂0.3毫升隔日灌胃，以健脾理气汤0.3毫升每天两次灌胃。 (4)对照组8只，以生理盐水0.3毫升每天两次灌胃。(所有药物剂量相当于体 重55公斤成人的305倍)[6) 6、处死方法及采血:所有动物在接种后第37天 (即饲药35天后)以脱椎 法处死，眼球摘除取血。 7、统计学处理:实验数据以SPSS10.0软件系统作t检验统计学处理。病理 免疫酶标强弱以x’检验。 8、血清VEGF检测:采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人VEGF单抗 包被于酶标板上，标准品和样品中的VEGF与单抗相结合，加入生物素化的抗 人VEGF抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm 处测OD值，VEGF浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中的VEGF 浓度。(由上海雄森科技实业有限公司提供人VEGF定量EIA试剂盒) 9、组织标本处理:组织标本采用Envision免疫组化二步法。HE染色切片。 VEGF多抗(SantaCruz,USA)，抗体稀释度1:100,MMP2单抗(Oncogene,USA), 抗体稀释度1:50.EnVision反应液由丹麦DAKO公司提供。(由复旦大学肿瘤医 院病理科协同完成) 10、观察指标:(1)动物体重。(电子称称重)(2)肝脏瘤重。(电子称称重) (3)实验动物一般情况。(体征、症状等)(4)腹腔转移灶数目。(肉眼)(5) 肺转移数目。(病理切片。分级按转移灶最大切面肿瘤细胞数。I级:肿瘤细胞数 10个。11级:肿瘤细胞数10-50个。III级:肿瘤细胞数50-80个。IV级:肿瘤 细胞数80个。)(6)血清VEGF浓度。(ugJmlaABC-ELISA法)(7)肝脏肿瘤 病理VEGF,MMP2免疫组化。(分强、中、弱三组)(8)肺转移病理VEGF, MMP2免疫组化。(分强、中、弱三组)