活性炭吸附分离琼胶酶解所得寡糖及其TLC检测.docVIP

活性炭吸附分离琼胶酶解所得寡糖及其TLC检测 粗酶液制备 将吴越09年8月31日的发酵液经4500r/min离心10min.取上清液得粗酶液，记为MY-2，保存于4℃冰箱备用。 酶解底物制备 称取琼脂0.9994g,加入500ml蒸馏水，煮沸溶解，冷却至35℃，装入1000ml烧杯。 酶解制备酶解产物 于500ml底物中加入100ml粗酶液MY-2，置于35℃摇床静置酶解。酶解48h。 活性炭预处理 将36g活性炭先以10%的稀盐酸200ml浸泡过夜。倒出稀盐酸，加入200ml无水乙醇浸泡，再倒出无水乙醇加入蒸馏水浸泡，最后将活性炭80℃烘干备用。 酶解产物的活性炭吸附分离 将酶解液置于沸水浴10min中断酶解反应。抽滤除去未酶解的琼脂。酶解液体积约为380ml。取5ml该液记为H0存于4℃冰箱。36.56g活性炭加入吸附30min以上。抽滤，滤液记为H1，取5ml存于4℃冰箱。活性炭加入10%乙醇250ml，平衡30min以上。抽滤，滤液记为H2，活性炭加入20%乙醇250ml。平衡30min以上。抽滤，滤液记为H3。活性炭加入30%乙醇250ml。平衡30min以上。抽滤，滤液记为H4。活性炭加入无水乙醇250ml。平衡30min以上。抽滤，滤液记为H5。将各滤液45℃旋蒸浓缩后，45℃真空干燥，最后冷冻干燥（H5未冷冻干燥）。所得H1重1.5166g。H2重0.2941g。H3重0.2303g。H4重0.1509g。H5重0.1317g。H1中以盐为主，H2、H3、H4、H5共重0.8070g且以糖为主，故总糖粗得率为80.75%。 寡糖的TLC检测 将目标物溶于一定量水或50%的乙醇，以玻璃点样毛细管将目标溶液点于硅胶板上，以不同的展开剂展开，展开后凉干或吹干，再喷上显色剂百里酚-硫酸，置于80℃显色数分钟。 H1、H2、H3、H4在自制硅胶G板上于展开剂正丁醇：乙酸：水（2：1：1）中展开后显色。由图显示H1中含糖量极低，H2、H3、H4中含有类似多种聚合度寡糖。 H5在自制硅胶G板上于展开剂正丁醇：乙酸：水（2：1：1）中展开后显色。由图显示H5中主要含有高聚合度的糖。 H1、H2、H3、H4在胶G板（购于青岛海洋化工厂分厂）上于展开剂正丁醇：乙酸：水（2：1：1）中展开后显色。由图显示H1中含糖量极低，H2、H3、H4中含有类似多种聚合度寡糖。 H1、H2、H3、H4在胶GF254板（购于浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）上于展开剂正丁醇：乙酸：水（2：1：1）中展开后显色。由图显示H1中含糖量极低，H2、H3、H4中含有类似多种聚合度寡糖。 H1、H2、H3、H4在胶G板（购于青岛海洋化工厂分厂）上于展开剂正丁醇：乙醇：水（3：2：2）中展开后显色。由图显示H1中含糖量极低，H2、H3、H4中含有类似多种聚合度寡糖。 H1、H2、H3、H4在胶GF254板（购于浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）上于展开剂正丁醇：乙醇：水（3：2：2）中展开后显色。由图显示H1中含糖量极低，H2、H3、H4中含有类似多种聚合度寡糖。 寡糖的DPPH?清除实验 取1mmol/L的DPPH?100μl于96孔板中，加入样品100μl，于酶标仪中检测OD490。同样于酶标仪中检测样品100μl加蒸馏水100μl、1mmol/L的DPPH?100μl加蒸馏水100μl在490nm处的吸光值。 清除率计算公式：[1-(Ap-Ac)/Amax]×100% Ap:样品+DPPH Ac：样品+蒸馏水 Amax：DPPH+蒸馏水 7.1 Vc的DPPH?清除实验 7.2 H1、H2、H3、H4的DPPH?清除实验 样品名称 H1 H2 H3 H4 浓度（mg/ml） 3.16 3.12 3.16 3.11 清除率（%） -10.31% 0.77% 41.27% 38.56%