根癌农杆菌介导的苜蓿体胚转化.PDFVIP

维普资讯 植物生理与分子生物学学报，JournalofPlantPhysiologyandMolecularBoiolyg 2003，29(2)：109—113 根癌农杆菌介导的苜蓿体胚转化 黎 茵 黄 霞 黄学林 (中山大学生命科学学院 ，教育部基因工程重点实验室 ，广州 510275) 摘要 ：以苜蓿体细胞胚胎作为根癌农杆茵介 导转化 的 继代后转人体胚诱导培养基和体胚发生培养基悬 受体 ．通过对 GUS基 因瞬时表达率的分析。研 究该转 浮培养 ，培养4—6周所得体胚作为转化受体。 化体系的最佳实验参数 。实验结果显示，负压处理 1O 1．3 质粒 min和共培养5d时表达率最高(可达 17．4％)。以这 转化用的质粒为 pCAMBIA2301(由中山大学 一 转化方法分别对带有 3种不 同启动子的表达载体进 生物工程 中心提供，带有以CaMV35S为启动子的 行比较 ．发现 由 CaMV35S启动子驱 动的 GUS基 因的 瞬时表达率 可达 82．7％，Ubil启动子驱动 的可达 GUS报告基因和 nptII基因)、pBA一35S、pBA—Ubi和 57．8％．而Actl启动子驱动的则未见表达。 pBA—Act(由本室黄霞博士构建 ，均含有 GUS报告 基因，分别 以CaMV35S、大麦 Ubil和水稻 Actl作 关键词 ：转化；苜蓿；体胚；GUS 启动子，另外还带有 Nos启动子调控的bar抗性基 中图分类号：Q943．1 因)。 1．4 农杆菌的活化 苜蓿作为一种重要 的饲料作物在全世界范 围 取内含供试质粒的EHA105农杆菌 。在含相应 内广为种植 ，同时它又是研究植物发育的一种模式 抗生素 (含 pCAMBIA2301质粒的菌株在培养基 中 植物。对其进行遗传转化 ，不仅可用来提高饲料的 加入卡那霉素至终浓度 100ms／L，含 pBA002系列 品质 ，也可以更方便地应用分子生物学的方法研究 质粒的菌株加入壮观霉素至终浓度 100ms／L，下 植物发育的机理。国外 已将 多种外源基因导人苜 同)的YEB平板上划线 ，28℃培养48h后 ，挑取单 蓿中(Desgagn6s等 1995，Ninkovi6等 1995，Trinh 菌落接人 5mL含相应抗生素 YEB液体培养基 ， 等 1998，Woo等 1999，Mckersie等 2000，Shao等 28℃振荡培养过夜 ，菌液稀释4倍后相同条件培养 2000)，并且在最近成功地利用转基因苜蓿表达了 3h备用 。 口蹄疫疫苗基 因(DusSantos等2002)。国内关于 1．5 感染与共培养 苜蓿转化的报告很少 (吕德扬等2000a、b)，这可能 1000×g离心 10min沉降菌体 ，用 SH液体培 与植物基因型、外植体来源以及转化条件有关。本 养基清洗菌体沉淀 2次，再用 SH液体培养基稀释 实验所采用的晋南苜蓿是我国栽培的牧草品种，该 至OD锄值 0．8—1．0，将苜蓿体胚切成 2—3mm 品种 尚未有外源基 因转化成功 的报告。我们在成 小块浸入菌液中进行负压处理 ，处理完毕用消毒滤 功地建立了晋南苜蓿体胚发生及其调控实验体系 纸吸去多余菌液 ，置愈伤组织诱导培养基上共培 的基础上 (黄学林等 1994，1995，1998，2001)，以苜 养，参照 Shao等(2ooo)的方法，在光暗周期 16h／8h， 蓿体胚为转化受体 ，摸索出了一个转化体系。通过 25℃下共培养2—5d。对照未经感染。 不同处理条件和不同启动子等试验 ，证明这是根癌 1．6 报告基因的检测 农杆菌转化苜蓿的一个好方法。