CHAPTER分子克隆工具酶.ppt

Chapter7 分子克隆工具酶 限制性内切核酸酶的命名 名 称 属名 种名 株名 序数 来源菌株 EcoRI E co R I Escherichia coli R HindIII H in d III Haemophilus influenzae HindII H in d II Haemophilus influenzae HindI H in d I Haemophilus influenzae 二、限制酶识别的序列 1、限制酶识别序列的长度 一般4-8bp，常见6bp ，当识别序列为4或者6bp时，他们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每44=256和46=4096bp中会出现一个识别位点。 2、限制酶识别序列的结构 一般为回文对称结构 EcoRI：G AATTC CTTAA G 3、限制酶切割的位置：大多在内部，也有在外部 A given molecule will generate a characteristic series of pattern when digested with a set of different enzymes. e.g. the combination of EcoRI + HindIII 三、限制酶切割产生的末端 1、匹配黏端(matched end) 识别位点为回文对称结构，产生的末端为匹配黏端(黏性末端，cohesive end)，形成的两个末端是相同的，也是互补的。 2、平末端(Blunt end) 在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端。 (3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端). (4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity. 许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbvCⅠ，它的识别切割位点 CC↓TCAGC GGAGT↑CG 有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如AccⅠ，它的识别切割位点如下，GT↓AT/CGAC????? CATA/GC↑TG (1)同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同。 HindⅡ与HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC (Y为C或T，R为A或G) HpaⅡ与 HapⅡ 识别切割位点为 C↓CGG MobⅠ与 Sau3AⅠ识别切割位点为 ↓GATC (2)同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为： KpnⅠ： GGTAC↓C Acc65Ⅰ： G↓GTACC (3)“同功多位” 许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。 如 EcoRⅠ识别和切割位点为 G↓AATTC ApoⅠ 识别和切割位点为 R↓AATTY 后者可识别前者的序列。 (4)其它有些限制酶识别的序列有交叉。 如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ位点（识别切割位点为 G↓TCGAC），该位点也可被 AccⅠ位点（识别切割位点为 GT↓MKAC）和HincⅡ位点（识别切割位点为GTY↓RAC）切割。 5、同尾酶(isocaudarner) 不同的 限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。 BamH I : G ↓ GATCC Bgl II : A ↓ GATCT 6、归位内切酶(homing endonuclease) 内含子编码的内切酶。 四、DNA末端长度对限制酶切割的影响 1、限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求。 2、酶单位：在适合的缓冲液及温度下，在20μl反应体系中反应1h，使1μgDNA完全消化所需要的酶量。 3、在设计PCR引物时，如果要在末端引入酶切位点，就需要考虑加上一些满足酶切要求的碱基数目。 五、位点偏爱(site preference) 对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，导致其对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。 1、酶切位点对酶的敏感性不同， 2、在切割相同量的不同DNA时所需要的酶量是不同的。 六、酶切