AtNDPK2基因转化紫花苜蓿的研究.pdfVIP

摘 要 紫花苜蓿（Medicago sativa L. ）是具有丰富营养价值的优质牧草，被全世界广泛种植。然而低温、 盐渍、干旱等多种逆境胁迫严重的制约着作物的生长，造成作物大幅度减产，对作物的生存构成威胁， 导致植被和生态环境的退化。因此，选择优良的抗逆相关基因通过基因工程手段，培育抗逆型更强的紫 花苜蓿新品种，不仅能够为苜蓿的遗传育种研究奠定坚实的理论基础，同时还会促进当今畜牧业发展。 本试验建立了黑龙江省主栽的苜蓿品种“敖汉”和“龙牧 801”的下胚轴再生系统，并以“敖汉” 下胚轴再生系统作为核苷二磷酸激酶 2 基因（AtNDPK2 ）转化的受体，通过农杆菌 EHA105 介导法转 化，对获得的转基因苜蓿植株进行了分子生物学检测和盐胁迫分析，所获得的结果如下： 1.“敖汉”和“龙牧801”两个品种的下胚轴都能在改良的 SH 基本培养基上诱导出愈伤组织，2 mg·L-1 2 ，4-D 和 0.15 mg·L-1 KT 的配合使用促进了胚性愈伤组织的形成，0.1 mg·L-1KT 有利于胚性愈伤的分化， 获得的“敖汉”愈伤组织诱导率为 100%，胚性愈伤分化率为 53.3%；“龙牧801”愈伤组织诱导率为 98.3%， 胚性愈伤分化率 37.5% ；1/2MS 有利于生根，两者生根率分别达到了 100%； 2.转化体系中抗生素压力筛选过程发现 350 mg·L-1 头孢霉素（Cef ）就能够有效抑制农杆菌EHA105 生长，50 mg·L-1 卡那霉素（Kan ）不影响下胚轴形成胚性愈伤；抗生素选择压确定过程发现：下胚轴对 Cef 不敏感，胚性愈伤组织诱导率不受 Cef 浓度影响；而下胚轴对 Kan 敏感，高浓度的 Kan 抑制胚性愈 伤组织的形成；研究预培养，共培养时间及筛选方式对抗性体胚诱导率的影响发现：5 d 预培养，2 d 共培养及延迟的筛选方式获得的抗性体胚率是最高的，获得的最终转化率为 23.3% ； 3.将获得的 23 株转基因植株经 PCR 初步检测，有 20 株目的基因已整合入染色体基因组中。在不同 浓度的 NaCl 胁迫下，测定转基因植株与对照植株叶片中 SOD、POD 活性及丙二醛含量，发现转基因 植株与对照植株相比在 0.4%～1.0%NaCl 胁迫下 SOD，POD 活性显著升高，丙二醛含量降低，充分说 明了AtNDPK2 基因的遗传转化增强了苜蓿植株对盐胁迫的忍耐性。 关键词: 紫花苜蓿；AtNDPK2 基因；遗传转化；盐胁迫 I Abstract Alfalfa (Medicago sativa L.) was a rich nutritional forage which was widely grown all over the wrold. However, Low temperature, salinization, drought and other adversities environment which seriously restricted the plant growth, reduced productivity and threated the survival of crop. It leaded to the continuous degradation of the vegetation and the ecological environment. Therefore, by means of genetic engineering, we selected excellent stress-related genes to cultivate new alfalfa varieties, which not only established a solid theoretical basis for the study of genetic breeding, but also promoted the development