C.sakazakii类胡萝卜素结构分析及其合成途径研究.pdfVIP

摘要 摘 要 Cronobacter sakazakii 阪崎克罗诺杆菌 （ ）能够合成类胡萝卜素。类胡萝卜素能够提 C. sakazakii C. sakazakii 高 对干燥和酸性环境的耐受性，与其致病能力密切相关。但是， 类胡萝卜素的组成、结构及其生物合成途径尚不清楚。本课题以C. sakazakii BAA-894 为研究对象，针对其类胡萝卜素成分和生物合成途径中的关键基因展开工作。主要研究 结论如下： 1 C. sakazakii BAA-894 C. sakazakii （）实验确定了 合成类胡萝卜素的主要成分。自 BAA-894 中提取、分离、纯化类胡萝卜素，通过薄层色谱、紫外可见光扫描、离子色谱 - C. sakazakii BAA-894 和液相色谱 质谱联用等分析手段，确定了 合成的类胡萝卜素主要 为单糖玉米黄素和双糖玉米黄素。 2 C. sakazakii BAA-894 crtE-idi-XYIBZ （）实验确定了 类胡萝卜素合成基因簇 。通 过Blast 序列同源比对，在C. sakazakii BAA-894 基因组DNA 中发现了一个与类胡萝卜 素合成相关的基因簇crtE-idi-XYIBZ 。这个基因簇中的七个ORF 与类胡萝卜素合成基因 crtE 、idi 、crtX 、crtY 、crtB 、crtI 和crtZ 具有很高的同源性。将基因簇crtE-idi-XYIBZ 在Escherichia coli DH5α 中异源表达，发现重组菌E. coli DH5α/pWSK29-EiZYIBX 也能合 成类胡萝卜素，通过提取、纯化和结构分析，确定其合成的类胡萝卜素是单糖玉米黄素 和双糖玉米黄素。这说明基因簇crtE-idi-XYIBZ 在C. sakazakii BAA-894 中起到合成类胡 萝卜素的作用。 3 C. sakazakii BAA-894 （）实验确定了 类胡萝卜素合成基因簇中关键基因的作用。 将基因簇crtE-idi-XYIBZ 中的关键基因在E. coli DH5α中串联表达，构建了六种重组菌： DH5α/pWSK29-i 、DH5α/pWSK29-Ei 、DH5α/pWSK29-EiB 、DH5α/pWSK29-EiIB 、 DH5α/pWSK29-EiYIB 和DH5α/pWSK29-EiZYIB 。通过提取、纯化和结构分析，发现 DH5α/pWSK29-EiIB 能够合成番茄红素，DH5α/pWSK29-EiYIB 能够合成β-胡萝卜素， DH5α/pWSK29-EiZYIB 能够合成隐黄质和玉米黄素。这进一步确定了基因簇 crtE-idi-XYIBZ 中关键基因在C. sakazakii BAA-894 类胡萝卜素合成中所起的作用。 4 idi C. sakazakii BAA-894 C. （）实验证实了 对于 类胡萝卜素合成的促进作用。 sakazakii 类胡萝卜素合成基因簇crtE-idi-XYIBZ 与普遍存在的基因簇crtEXYIBZ 相比多 idi idi 了异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因 ，为了研究 对类胡萝卜素合成的影响，构建了 重组菌C. sakazakii BAA-894/pWSK2