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摘要：在进行基因分离、克隆和核苷酸序列分析等生物过程中，通常会运用到聚合酶链反应技术，即PCR技术。荧光PCR是近年来科学家和学者常用的手段，本文就对荧光PCR的原理、常用探针的优缺点以及多重荧光PCR技术的进展进行了综述。关键词：荧光PCR；探针；多重荧光PCR聚合酶链反应( PCR) 技术自1985年问世以来，以其灵敏性高、特异性强和速度快在分子生物学等科研领域得到了广泛应用[1]。但是，利用传统的PCR 技术进行检测鉴定时，需要进行扩增反应后的电泳分离及染色处理，且不能准确定量，使其应用受到限制[2]。荧光PCR技术拥有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，已成为了分子生物学研究的重要工具[1]。1、荧光PCR原理荧光PCR的原理是以荧光共振能量转移原理为基础。荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。Ct值是实时荧光PCR 中一个很关键的因素，C 代表循环（Cycle），t代表阈值（Threshold）。每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。因此，根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR 产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行检测并获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。与普通PCR相比，荧光PCR可以利用荧光信号实时监测PCR反应过程中每一个循环扩增产物的变化，可以对初始模板量进行定量分析。概括地说，荧光PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量[2]。2、常用探针及其优缺点目前，常用的探针有全基因组核酸探针、克隆探针、寡核苷酸探针、单链RNA探针、cDNA探针、蛋白质探针以及酶探针。（1）全基因组核酸探针利用全部染色体DNA或部分DNA作为探针。主要用于区别某些种属的遗传相关性较小的生物，其优点在于：探针的制备简单、价廉；在传统的DNA-DNA分子杂交技术中，由于利用了尽可能多的杂交位点，因而最敏感，适用于检验经纯化培养的细菌。但此类探针的特异性较差，因而有可能出现交叉反应而导致假阳性结果，有一定的局限性。（2）克隆探针此类探针可以是整个重组的质粒，也可以是经限制醉切下的特异基因或其中的某一片段，它们的共同特点是即具有全染色体探针的敏感性，又避免了相关物种间的交叉反应。对于细菌来说，可用于鉴别细菌的毒力株或非毒力株。但这类探针的制备条件要求较高，需事先将生物的特殊DNA片段分离出来并克隆入适当的载体中，然后用杂交方法筛选和鉴定含特异DNA片段的克隆。（3）寡核苷酸探针这是在详细分析了解某一生物的特异核酸序列，或从已知蛋白质氨基酸顺序按相应密码子推导出DNA的碱基顺序的基础上，选择其中最特异的区域由人工合成的短链探针(碱基数常在10-50个之间)，其特点是：特异性较高，往往能区别染色体上一个碱基的突变；由于其链短，分子量小，因而杂交时间较短（仅需1-2小时），而且可预测杂交条件；可直接利用DNA序列人工合成获得特异片段而无需分子克隆，获得探针相对容易。但另一方面由于其链短致使标记率较低，影响了检测的敏感性，往往仅能检出含很少的标本[3]。如，TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，PCR 扩增时，加入一对引物的同时，再加入一个特异性的荧光探针，其结合位点在两条引物之间，只与模板特异地结合。荧光报告基团(reporter，R)连接在探针的5’末端，而荧光淬灭基团则在3’末端。当完整的探针与目标序列杂交时，荧光基团发射的荧光信号与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。其缺点是价格昂贵[4]。（4）RNA探针此类探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA：DNA杂交体比DNA：DNA杂交体有更高的稳定性，所以在杂交反应中RNA探针比相同活性的DNA探针所产生信号要强。RNA：RNA杂交体酶切时比DNA：RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。（5）cDNA探针以RNA为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针。cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列之间有很