食品微生物检验单增李斯特菌.docVIP

食品中单增李斯特检测技术李斯特氏菌属包括七个种： 单核细胞增生李斯特氏菌 绵羊李斯特氏菌 英诺克李斯特氏菌 威尔斯李斯特氏菌 西尔李斯特氏菌 格氏李斯特氏菌 默氏李斯特氏菌 其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。 单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。 它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。 它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状。 兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性。 该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。 该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2－5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。 该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8－4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。 在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。 在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。 在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45度角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。 该菌触酶阳性，氧化酶阴性。 发酵多种糖类，产酸不产气。 如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。 不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。 不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解。 吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。 VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。 　 该菌对理化因素抵抗力较强。 在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活。 对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。 李斯特氏菌(Listeria)是条件致病菌，大多为散发病例，也可因污染食品而爆发。　 本菌能产生一种溶血素性质的外毒素。能引起人和牛、绵羊等动物的脑膜炎，可使家兔豚鼠等实验动物感染引起血中单核细胞增高。 　　 可引起婴儿及新生儿的化脓性脑膜炎或脑膜脑炎，死亡率可达70%。子宫内感染的新生儿可导致新生儿李斯特氏菌病、流产、死胎或习惯性流产。SN 0184-93 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法 样品：冷冻样品，2－5℃解冻，不超过18h 若不能及时检验，应置于－15 ℃保存。 非冷冻易腐样品应尽可能及时检验。 若不能及时检验，应置于4 ℃冰箱保存，在24h之内检验。 两次增菌： 巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品、冻肉及其它加工食品应该前增菌。 25g＋225ml改良缓冲蛋白胨水，均质。 30 ℃培养18－24h，移取1ml接种于100ml增菌培养液（EB)中，30 ℃培养24、48h，分别进行分离。 直接增菌： 生乳、鲜肉以及未经加工处理过的样品。 25g＋225ml 增菌培养液，30 ℃培养24和48h，分别进行分离。分离： 划线接种于MMA或者OXA平板，35 ℃培养24－48h。 斜射光镜检。MMA平板： 蓝色或者兰灰色扁平圆润，稍有凸起边缘整齐 菌落较小，约为0.5mm左右OXA平板： 菌落呈黑色，直径1mm， 在其周围形成一个黑色环。从MMA或OXA上挑取5个可疑菌落，接种TSA-YE平板，进行纯培养。 纯化菌落再转接到TSB-YE肉汤，35℃培养24h。 进行生化试验。 典型运动镜检： 从TSA-YE平板挑取生长良好的菌落于洁净载玻片上。 用0.85%灭菌生理盐水制成悬浮液。 在显微镜下用油镜观察。 短棒状杆菌，显微镜下可见轻微旋转和翻滚。过氧化氢酶： 过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。 菌落－平板－1滴3％的过氧化氢。 阳性。过氧化氢酶实验也可以在试管中进行革兰氏染色镜检： 革兰氏阳性溶血试验： 7％羊血琼脂平板，划分小格，刺种菌落。 做阳性对照和阴性对照（英诺克李斯特氏菌）。 35 ℃培养24－48h，于明亮处观察。 单核细