盐酸小檗碱提取纯化及生物活性测定.pdf

盐酸小蘖碱的提取纯化及 生物活性测定 第一组 蒋攀振，蔡海龙，包文君，马洪智， 吴峰，何磊 实验目的与要求  学习生物碱的初步提取分离方法。  掌握利用柱层析分离纯化、薄层层析鉴定 药用植物成分的方法。 基本原理  小檗碱又名黄连素,是最先由毛莨科黄连和芸香科黄柏等植物中提出 的一种黄色生物碱。  三颗针及黄连中均含有小檗碱(分别为1%,5.1%)以及巴马亭(掌叶防已 碱)、药根碱等,它们均有明显的抗炎作用。  本实验即是用小檗属植物三颗针作为提取小檗碱的原料;  小檗碱是一种季铵碱,其游离碱为黄色针晶,Mp.145℃(乙醚),微溶于 水,能溶于热水和乙醇中，难溶于苯、丙酮、氯仿，几乎不溶于石油 醚。小檗碱与氯仿、丙酮、苯在碱性条件下均能形成加成物。小檗碱 盐酸盐难溶于冷水，易溶于热水；硫酸盐易溶于水。溶解度分别为: 小檗碱,1∶２０（冷水）,1∶100(冷乙醇);盐酸盐,1∶500(冷水);硫 酸盐,1∶30(冷水),利用这些特性提取盐酸小檗碱。 仪器与试剂  仪器  层析柱、研钵、烧杯、硅胶薄层板、滤纸、抽滤装置、紫外 灯、层析缸等电磁炉，SHP-250生化培养箱，XXQ-LS-50SⅡ 立式压力蒸汽灭菌器，SKJH-1109生化超净工作台，MP500Z 电子天平,BKH-BC型玻璃仪器快速烘干器，搪瓷缸，锥形瓶， 酒精灯，打孔器,接种环，培养皿，25mL具塞刻度试管，纱 布等。  试剂与样品  三颗针根粉(或黄连根粉),0.5%硫酸，石英砂，脱脂棉，石 灰乳，10%盐酸，浓盐酸，氧化铝，95%乙醇，无水乙醇，10 ％氢氧化钠溶液,滤纸，硅胶，氯仿-氨-甲醇(30∶1∶8),氯 仿-乙醇-0.1mol.L－1盐酸(1∶1∶1，下层)，丙酮，葡萄糖， 琼脂粉，75%乙醇。  供试菌种 由学院相关实验室提供  供试药剂 盐酸小檗碱 实验内容与步骤  小檗碱粗品的制备  取三颗针的根粗粉(过20目筛)20g,置于500mL烧杯中， 加入8倍量0.5%硫酸水溶液使之浸没药面,浸泡24h，用 脱脂棉过滤。滤液加石灰乳中和多余硫酸,调pH＝12, 静置30min，滤除沉淀,滤液用10%盐酸调至pH2-3,再向 滤液中加10% （W/V）量食盐[3],搅拌使完全溶解后， 继续搅拌至溶液出现为混浊现象为止，静置(过夜),滤 出沉淀。并用少量水洗涤至中性,抽干。50℃以下真空 干燥,即为盐酸小檗碱粗品。  盐酸小檗碱精制  取所得粗品(未干燥)放入20倍量沸水中，搅拌 溶解后，继续加热数分钟，趁热过滤。滤液滴 加一滴浓盐酸，静置(过夜),滤取结晶，用蒸馏 水洗数次,抽干，50℃以下真空干燥，即为精制 盐酸小檗碱  氧化铝柱层析分离纯化盐酸小檗碱  层析柱制备：2.0cm×30cm柱，层析氧化铝120- 140目,25-30g  进样：取约50mg盐酸小檗碱粗品，用尽量少的 无水乙醇溶解制成溶液  洗脱样品：按每流分5-10mL收集洗脱液  氧化铝再生回收  盐酸小檗碱的硅胶薄层层析鉴定  展开剂:氯仿-氨-甲醇(30∶1∶8)  培养基  PDA （去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、 水1000mL），分装，0.11Mp、121℃灭菌30分钟  菌种准备  在9cm平板连续培养几代，然后在试验前3天再 接种一次，在28℃培养基条件下培养备用。  药液准备  将25.2mg的供试药品溶于5mL丙酮中备用。  打制菌饼  在无菌条件下，将供试菌种在同一半径下用