高效液相色谱法20120425.pptVIP

第20章 高效液相色谱法 20.1 概述 20.2 高效液相色谱仪 20.3 高效液相色谱固定相和流动相 20.4 液相色谱分离分析法 20.1 概述 一、高效液相色谱的特点 二、高效液相色谱的分类 分析对象 气相色谱：气体和沸点较低的化合物，占有机物总数20% 高效液相色谱：高沸点、热稳定性差、分子量大的物质，占有机物总数80% 一、高效液相色谱的特点 高压： 150 - 350 ?105 Pa 高速： 一般 1 h, 1min. 高效： 柱效高 高灵敏度： 10-9 g（紫外检测器） 10-12 g（荧光检测器） 二、高效液相色谱的分类 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 尺寸排阻色谱 疏水作用色谱 (2) 梯度淋洗装置 (3) 进样装置 (4) 高效分离柱 (5) 液相色谱检测器 b. 光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器 c. 示差折光检测器 d. 荧光检测器 一、液相色谱固定相 （3）化学键合固定相 化学键合固定相的特点 2.液-固吸附分离固定相 3.离子交换色谱分离固定相 4. 空间排阻分离固定相 二、液相色谱的流动相 2. 流动相类别 3. 流动相选择 1. 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小) * * 流动相 气相色谱：对组分没有亲和力的惰性气体，对分离选择性几乎无影响 高效液相色谱：可选用不同极性的液体；选择余地大；对分离影响大（与组分或固定相均作用） 色谱柱温 气相色谱：一般较高 高效液相色谱：通常为室温 高效液相色谱 vs 气相色谱 成本高、环境污染、梯度洗脱操作复杂； 缺少灵敏度高的通用型检测器； 复杂样品分离，缺少总理论塔板数达数十万的色谱柱； 受压易分解或变性的生物样品。 优点： 局限： 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析 按分离原理 制备色谱 柱内径10mm 半制备色谱 柱内径5-10mm 分析型色谱 柱内径 5 mm 按分离规模 20.2 高效液相色谱仪 1.流程 一、流程及主要部件 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 附属系统 2.主要部件 (1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa； 为获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一； 具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。 柱塞式往复泵 外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示： 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 匀浆法装柱示意图 高效液相色谱填料 填料的热力学特性影响色谱柱的选择性 填料的动力学性质或结构特点影响色谱柱的效率（颗粒的大小、形状、均匀性、比表面积；孔径、孔体积等）。 基质 无机基质材料 硅胶(silica)、氧化铝、氧化锆