(农业硕士生物技术课件)转基因技术与作物育种.ppt

* 4.胚状体再生系统 是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。 5.生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。 * （四）转基因方法 概括起来说主要有两类： 第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。 第二类是外源目的DNA的直接转化。 * 1.载体介导转移系统 最常见的转基因方法。 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcing?plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。 * 农杆菌共培养侵染 诱导愈伤组织 分化生芽 生根 叶盘转化法 (1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。 * (2)真空渗入法 将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。 简便、快速、可靠，不需要组织培养。 (3)愈伤组织共培养 (4)原生质体共培养 * 2.外源基因直接导入法 （1）化学刺激法 细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC） * (2)基因枪轰击法 （微弹轰击技术micro-projectile bombardment) 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。 步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。 单子叶植物 * 1. 撕开果皮取出未成熟的胚. 2. 未成熟的置于培养皿中 高渗透介质 Transformation is performed by gene gun method * * (4)微注射法 细胞操作： 利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。 子房注射法或花粉管通道法： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。 * （五）转化体的筛选和鉴定 1.转化体的筛选 外源目的基因转化频率低 目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少 使用特异性选择标记基因（selectable marker genes）进行标记，有效地选择出真正转化细胞。 常用选择标记基因： 抗生素抗性基因 除草剂抗性基因 将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。 标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。 * 2.转化体的鉴定 通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达，还必须对抗性植株进一步检测。 DNA水平的鉴定 检测内容：是否整合、拷贝数、整合位置。 检测方法：特异性PCR（以外源基因两侧序列设计引物） Southern杂交（外源目的基因序列为探针） * 特异性PCR检测外源基因整合到受体 * (2) 转录水平的鉴定 常用的方法 Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交） RT-PCR 检测 mRNA cDNA PCR * * （3）翻译水平的鉴定 为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。 主要方法：Western杂交 免疫检测 * （六）转化体的安全性评价和育种利用 根据有关转基因产品的管理规定、在可控制的条件下进行安全性评价和大田育种利用研究。 通过转基因方法往往难以直接获得理想的品种（系）原因：外源基因失活、纯合致死、花粉致死、其它性状变化等。 因此获得转化体后，应结合杂交、回交、自交等常规转育手段，最终选育综合性状优良的转基因品种。 * 第二 转基因作物的遗传特点 少数外源基因整合到植株能稳定遗传，正常表达，符合孟德尔遗传。 大多失活或表现