浓集红细胞悬液中的残存白细胞表面暴露的磷脂酰-中国显微图像网.pdfVIP

中国科技论文在线 浓集红细胞悬液中的残存白细胞表面暴露的磷脂酰丝 氨酸与促凝血活性的关系1 周晋，于洪娟，侯金晓，吕成芳，刘述川 哈尔滨医科大学附属第一医院 血液内科，哈尔滨（150001 ） E-mail: zhoujin1111@126.com 摘 要：目的研究标准血库条件下，浓集红细胞悬液中残存的白细胞在不同储存时间内暴 露的磷脂酰丝氨酸（PS ）与促凝血活性之间的关系。方法 通过血浆复钙时间、共聚焦显微 镜及流式细胞仪对残存白细胞表面的 PS 及相关的促凝血活性进行研究。结果 随着储存时 间延长，白细胞促凝血活性增强，64nM 的annexin V 能够显著抑制凝血反应。流式细胞仪 及共聚焦显微镜结果显示，储存白细胞表面暴露的 PS 增加。结论 随着储存时间延长，浓 集红细胞悬液中残存的白细胞表面暴露的PS 增多，是促凝血活性增强的重要因素。 关键词：储存白细胞；磷脂酰丝氨酸；促凝血活性 红细胞浓集液在成分输血中占有重要地位。随着白细胞滤器的广泛使用，红细胞浓集液 中残存的白细胞已显著减少，但在临床输入红细胞浓集液的过程中，亦伴有白细胞的输入。 白细胞结构和功能复杂，在输血医学中，输入白细胞能够导致机体发生免疫反应，并传播疾 病[1-3] 。而输入白细胞对机体促凝血活性的影响尚不清楚。本实验研究了标准血库储存条件 下，浓集红细胞悬液中残存的白细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸（PS ）与促凝血活性之间 的关系。 1 材料 1.1 标本来源、准备和保存 浓集红细胞悬液由哈尔滨医科大学第一临床医学院 5 个健康志愿者捐献，每份 100ml， 并于 4°C 标准血库条件下保存。保存血袋含有复合抗凝剂及 GASM 添加剂。每次实验均在 严格无菌条件下应用 8 号注射器抽取标本 10~15ml，加入等体积的 PBS 稀释，白细胞分离 液 1：1 密度梯度离心，2000rpm，20min，无菌吸管小心收集白膜层至另一清洁试管内，加 入适量 PBS，1000rpm，5min 洗涤三次，收获白细胞悬浮备用。 1.2 试剂 牛血清白蛋白（BSA ）购自于Avanti Polar Lipids （Alabaster, AL ）；HEPES–BSA 缓冲液 由50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2 及 1mg/ml BSA 组成（pH 7.5 ）；10×TBS 由50mM Tris 和 150mM NaCl 组成（pH 7.4 ）。乏血小板血浆通过取新鲜健康人全血50ml，1：9 （v/v ） 3.8%枸橼酸钠抗凝，1200rpm，5min 离心后取上清，4000rpm，15min 离心去血小板，立即 分装，-80°C 冷冻保存。Annexin V 和异硫氰酸荧光素（FITC ）标记的annexin V 购自于 BD Biosciences （San José, CA）。 2 实验方法 2.1 复钙时间及抑制实验 1基金项目：国家自然科学基金资助项目）；国家教育部博士点专项科研基金（20060226017 ） -1- 中国科技论文在线 通过一步血浆复钙时间测定对储存的浓集红细胞悬液中残存的白细胞进行促凝血活性 分析。简要操作如下：100µl 白细胞悬液(106/ml ，分别于储存第 0、2 、7、14、21 、35 天取 出)与 100µl 含有枸橼酸钠抗凝的正常乏血小板血浆混合，用 KC4A 血凝仪（Amelung, Labcon, Heppenheim, Germany ）在37°C 共同孵育 180s 后，由加入 100µl 的25mM CaCl2 启动凝血反 应，读取凝血时间。对于抑制实验，先将白细胞与 annexin V （终浓度为64nM ）于37°C 孵 育 10min，将二者的混合物再与乏血小板血浆共同孵育 180s，随后加入 50µl 50mM 的CaCl2 启动凝血反应，读取实验结果，重复 3 次，取平均值。 2.2 共聚焦显微镜定位残存白细胞表面