螯合稀土金属标记蛋白质技术的建立及优化.pdfVIP

HUAXUE)研究报告 第lO期 第38卷 分析化学(FENXI ChineseJournalof 1393～1399 2010年10月 AnalyticalChemistry DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．01393 螯合稀土金属标记蛋白质技术的建立与优化 米薇1 王晶1 应万涛2 蔡耘2 钱小红以 1(中国计量科学研究院生物能源环境所，北京100013) 2(蛋白质组学国家重点实验室，北京蛋白质组研究中心，北京放射与辐射医学研究所，北京102206) mmoL／L 摘要建立了一种基于螯合稀土金属标记蛋白质的技术，优化了影响标记效率的各种条件。在50 TEAB缓冲体系(pH7．5)，DTPA与肽段摩尔比为100：1，常温反应30min的条件下，DTPA标记完全；在 100 h的条件下，稀土金属螯合 mmol／L乙酸铵缓冲液(pH6．0)，稀土金属与DTPA摩尔比为4：1，37℃反应1 反应完全。考察了不同稀土金属的螯合效率，发现离子半径最小的hl螯合效率最高。本方法被成功应用于 肽混合物标记。 关键词质谱；螯合稀土金属标记；蛋白质定量 1 引 言 近年来，为满足蛋白质定量研究的需要，通过蛋白质标记进行质谱定量分析的相关标记技术发展迅 速【l。】。这些标记方法通常对蛋白质或肽段的N或C末段，或是标签氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸、精 氨酸等)两1进行标记，并且已经成功应用于蛋白质的定量分析，如乙酰化标记川，180标记¨’9J， ICAT【1 3以化学性质很相近的稀土金属元素为质量标签，提出了针对蛋 o．…，ITRAQ¨2131等。Meares等¨4 白质巯基标记的新方法“元素标记亲和标签”(Element-codedaffinitytags，ECAT)。利用稀土金属元素进 行蛋白质标记有许多优点：与稳定同位素试剂相比，稀土金属价格便宜，物理化学性质非常相近，并且可 选择的稀土元素较多，扩展了蛋白质金属标记的选择范围；利用这种标记方法不仅可以通过生物质谱进 行蛋白质定量分析【l5|，而且还能利用无机质谱对蛋白质进行定量分析，具有检测灵敏度高，定量动态范 围大的特点‘16,17]。但是稀土金属元素标记需要经过两步反应，每一步的反应效率都将影响定量结果。 因此，标记反应效率的优化对于基于此方法的蛋白质定量分析十分关键。 本研究以肯普肽为模型，对螯合稀土金属标记肽段的反应条件进行了优化，考察了不同稀土金属的 螯合效率。实验结果显示，优化后的标记方法可用于肽段混合物。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 4800Proteomics MS，美国 Analyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI—TOF—TOF Savant公司)；分析天 ABI公司)，控制软件为4700Explorer(TM)Software；真空冷冻干燥机(美国Thermo 平(瑞士Sartorius公司)。 acid triamine．N，N，N’，』v，，，胪．pentaaeetie 2．2实验方法 1 nmol mmol／L TEAB溶液(pH7．5)，加入 2．2．1双酸酐标记反应20izL Kemptide，缓冲液