干扰素基因工程法生产和构建.docVIP

课程论文！！！！！！！！干扰素基因工程法生产和构建(2006-04-14 21:51:59)转载▼ 干扰素最早是由英国科学家 Isaacs 和 LindeImam1 于 1957 年发现的。他们在研究病毒干扰现象时 , 将 56 ℃加热 1h 灭活的流感病毒加入到鸡胚绒毛尿囊膜碎片中 , 孵育后发现此膜能抵抗活流感病毒的感染 , 并且向外周释放具有干扰活性的因子 , 离心后吸取的上清液能使别的鸡胚绒毛尿囊膜碎片获得对病毒的抗性 , 他们将该物质称为干扰素 (interferon,IFN) 。此后 , 1965 年发现了白细胞干扰素 ,1969 年发现了致敏细胞干扰素。从此 , 关于干扰素的研究便红红火火地展开了 O 一、序列结构干扰素的序列结构见图 12-10 第一节 概述 二、分类 国际干扰素命名委员会 1980 年对干扰素下的定义为 : 一种在同种细胞上具有广谱抗病毒 活性的蛋白质。现在 , →般指脊椎动物细胞受干扰素诱生剂作用后合成的一类具有细胞功能 调节作用的蛋白 O 人干扰素根据其来源细胞不同 , 分为白细胞干扰素 (IFN- α ) 、类淋巴细胞干 扰素 (IFN- α与 IFN 币的混合物 ) 、成纤维细胞干扰素 (IFNmp) 、 T 细胞干扰素 ( 又称为免疫干扰素，IFN-r)等几类，其理化性质如表12-1。 对上表还应说明的是 IFN- α目前常用的为 IFN- α I KEN- α II a 和 IFN- α II bo 其中 IFN- α Ib 由 166 个氨基酸组成 , 相对分子量约为 19329, 含有 5 个 Cys, 形成两个二硫键 , 其余一个 Cys 的存在使其易形成二聚体 , 降低活性。其等电点介于 5~6 之间。 IFN- α H a 由 165 个氨基酸组成 , 相对分子量约为 19219, 有 4 个 cys,1 位 Cys 与 98 位 Cys 、 29 位 Cys 与 138 位 Cys 之间形成两个二硫键 , 而后者对其活性有很重要的作用。 IFN- α H a 等电点介于 576 之间 , 在 PH2.5 时较 IFN- α E a 稳定 , 对热稳定 , 对蛋白酶敏感。 IFN- α H b 与 IFN- α H a 只相差一个氨基酸 , 即 23 位的 Lys 改为 Arg, 性质也相仿 O 另外叭利用基因工程方法表达的 IFN- γ与天然的 IFN- γ也有所不同。未然的 IFN-y 由 146= 个氨基酸组成 , 相对分子量约为 20000~25000 。而用基因工程表达的 IFN- γ为了提高活性 , 去除了 Nm 端的 3 个氨基酸 , 其相对分子量只有 16675 。重组 IFN- γ的 C 端不齐 , 被蛋白酶在 Arg 、 Lys 处及其他氨基酸等多处水解后形成长度不同的分子 , 但大都保留了活性。三、生物学活性 干扰素作为免疫系统抵御外源物质的一种手段 , 其作用有 : ①抑制病毒等细胞内微生物的 增殖 ; ②抗细胞增殖 ; ③通过作用于巨噬细胞、 NK 细胞、 T 淋巴细胞、 B 淋巴细胞而进行免疫调节 ; ④改变细胞表面的状态 , 使负电荷增加 , 组织相容性抗原表达增加 ; ⑤增加细胞对双链 DNA 的敏感性。研究表明 ,IFN- α可抗血中艾滋病毒、肝炎病毒 ,IFN-R 能有效地治疗病毒引 起的带状痕瘁 , 对乳腺癌、肾细胞癌、恶性黑色素瘤等也有一定的作用。 IFN- α、 IFN-O 与 IFN- γ合用在抗肿瘤方面的应用也在研究中 O 四、传统方法生产干扰素 由于干扰素有高度的种属特异性 , 所以起初临床使用的干扰素都用人的细胞制备。α干 扰素用人血白细胞或淋巴细胞制备 , 自干扰素用人成纤维细胞制备。但传统方法的不利之处限制了其在医疗方面的应用 : ①成本高 O 以白细胞干扰素为例 , 芬兰 Cantell 实验室在 1979 年从 45000L 血中才生产了 200mg 干扰素 , 由此估计 ,1kg 纯干扰素价值约 220~440 亿美元 , 1992 年西格玛公司的标价是 IFN- α 182.2 美元 /100 万 U,IFN- γ 213.6 美元 /50 万 U, 而用 IFN- α治疗一位肝炎病人需要 3 万美元。②组分多。一种细胞在诱生剂作用下产生的为多种干扰素的混和物。如白细胞产生的 99% 为α干扰素 ,1% 为自干扰素。 Namalva 细胞产生的 80% 为α干扰素 ,20% 为自干扰素。③纯度低 , 活性低。用病毒或 polyI:C 处理外周血白细胞、类淋巴母细胞 (Namalva) 、成纤维母细胞 , 得到的均为混合物 , 用传统方法大量生产的干扰素的纯度最高也只有 1%, 活性在 10000~5