小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞的基因芯片分析-生物化学与生物物理进展.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2009, 36(1): 95~ 102 小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞的基因芯片分析* 李岩 李雪飞 郭 坤 高东梅 赵 燕 刘银坤** ( 旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海200032) 摘要 弄清胚胎肝脏发育的分化调节机制，对指导干细胞在肝再生中的应用以及研究肝分化相关疾病分子机制具有重要意 义 胚胎干细胞的全能性使得体外建立肝向分化模型成为可能，采用单层贴壁培养方式，分阶段加入成纤维细胞生长因子 (FGF) 、肝细胞生长因子(HGF) 、制瘤素(OSM)等因子，诱导小鼠胚胎干细胞D3(mESC-D3)的肝向分化 分化细胞在光 和电 镜下呈现肝样细胞形态，RT-PCR、细胞免疫荧光检测以及PAS 染色分析表明，这些细胞具有肝细胞特征性的基因表达和生 化功能 采用干细胞分化相关基因芯片比较早期肝定向分化前后的基因表达差异，结果显示，48 个差异表达基因中(大于2 倍)，20 个上调、28 个下调 进一步的生物信息学分析发现，它们集中体现在细胞外基质、细胞连接、FGF、BMP 分子及 Notch 、Wnt 信号通路上，提示这些改变可能与胚胎早期的肝向分化密切相关 关键词 胚胎干细胞，肝细胞，细胞分化，基因芯片 学科分类号 Q254 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2008.000 10 胚胎干细胞的无限自我更新能力及多向分化潜 康星大学馈赠 能使 可能成为一种良好的再生细胞资源 尽管人 1 1 2 细胞培养基 mESC-D3 培养基：高糖型 们在胚胎干细胞的肝向分化方面已开展了大量研究 DMEM (Gibco-BRL 公司) ，含 15% 胎牛 清、 工作[1～8]，这个领域目前仍处在萌芽阶段，分化率 0.1 mmol/L - 巯基乙醇、1%非必需氨基酸、1%丙 低、细胞不成熟是突出问题，得到有完全功能的成 酮酸钠、100 U/ml 青链霉素(Gibco-BRL 公司) 和 熟肝细胞一直是所有研究者的努力目标[9, 10] 鉴于 1 000 U/ml 重组小鼠白 病抑制因子(leukemia 自然过程中肝脏发育的 杂性，综合模拟 中涉及 inhibitory factor, LIF)(Chemicon 公司) 分化基本培 的各种信号对实现高效、可重 的分化是相当重要 养基：不含LIF 的mESC-D3 培养基 饲养层小鼠 的 另外，随着近来 “肿瘤干细胞”概念的提出， 胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF) 肝癌细胞起源涉及的异常分化调节也开始引起人们 培养基：高糖型DMEM ，含10%胎牛 清 的重视[11～14] 所以，着眼于分化机制的研究，对于 1 1 3 诱导因素 酸碱性成纤维细胞生长因子 将来干细胞在肝再生上的应用以及阐明肝癌发生的 (aFGF，bFGF) 、肝细胞生长因子(HGF) 、制瘤素 异常分化调节机制都具有重要意义 基因芯片技术 (OSM)(RD 公司) ；明胶、 型胶原、维甲酸、地 玉 的应用使得同时分析生物过程中多个调节通路成为 塞米松、牛 清白蛋白、维生素C (Sigma 公司) ； 可能 本研究参照小鼠胚胎肝脏早期发育的阶段 ITS(Gibco-BRL 公司) 性，采用FGF、HGF、OSM 等因子，体外建立了 1 1 4 PCR 试剂 Trizol(Invitrogen 公司) ；逆转录 小鼠胚胎干细胞的肝向分化模型，首次采用干细胞 试剂盒、Taq DNA 聚合酶(MBI 公司) ；Real-time 分化相关的功能分类基因芯片分析早期肝定向分化 PCR 试剂盒(北京天根生物公司) ；引物由上海生工 前后的基因表达差异，为进一步寻找分化关键基 生物公司合成，引物序列见表1 和表2 因、阐明分化调节机制提供线索 1 材料和方法 * 国家“十五”科技攻关资助项目(2004BA