耐热碱性磷酸醋酶的基因克隆及在大肠杆菌中的表达.pdfVIP

遗 传 学 报，25(4):375-380,1998 ActaGenedcaSinica 耐热碱性磷酸醋酶的基因克隆 及在大肠杆菌中的表达 袁有忠 盛小禹 吕鸿雁 咚 石 毛裕民 复（旦大学遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室 上海 200433) 摘要 以pUC118质粒为载体，以E.coliTG1为受体，构建了产耐热碱性磷酸酷酶 (FD-TAP）的菌株Thermussp.FD3041的染色体基因文库。在包含1.2万个转化子的文库中， 90％的转化子插入有3-lOkb的外源DNA片段。用菌落原位碱性磷酸酚酶显色法从文库中 筛选到5个阳性克隆。对其中的1个克隆p（TAP362)所产的TAP进行了研究，发现克隆的 TAP与出发菌株所产的TAP的热稳定性、最适反应温度和最适pH等性质都相同。通过做物 理图谱和测定部分缺失的质粒的TAP活性，将TAP基因定位于2kb的Barnes1-HindMDNA 片段上。模拟PCR实验表明该酶可用于PCR扩增产物的检出。 关键词 耐热碱性磷酸醋酶，基因克隆，表达 分类号 0523 碱性磷酸醋酶(AP)是广泛存在于各种生物体内、参与细胞磷代谢的重要酶类It]。在 医学上，血清中AP浓度是骨骼、肝脏等疾病的重要诊断指标。AP也是分子生物学研究的 重要工具酶，在基因克隆中用于DNA或RNA片段末端的去磷处理，在免疫学研究中用作 酶联试剂[2]［.10多年前，在 Southern和Northern印迹分析中已有用AP代替同位素标记 探针检测产物的报道t3l。近年来，文献中用AP代替放射性同位素作探针标记的报道越来 越多4[-［l,Promega等公司已推出”标记寡核昔酸的试剂盒。但由于所用的AP来自嗜温 生物，不能适应于较高温度下操作的实验，而较高的杂交温度有利于降低杂交背景和增加 特异性，因此应用受到一定限制。本实验室从栖热菌中筛选到 1株产耐热碱性磷酸醋酶 (FD-TAP，在前文中记为FD-AP）的菌株7hermussp.FD304118l，所产的FD-TAP在95C 中保温60min仍保留原来活力的75%，并且耐pH12和耐去污剂 1（%SDS)。为了进一步研 究该酶的结构和功能的关系并开发利用，我们进行了FD--TAP的基因克隆，获得成功。关 于耐热碱性磷酸醋酶的基因克隆属首次报道。 1材料和方法 1.1 材料 1.1.1菌株和质粒 产耐热碱性磷酸醋酶的栖热菌7hermussp.FD3041由本室从国 内一温泉中筛选获得81［E.coliTGl{supEHsdD5thiD(lac-proAB)Fr[traD36proAB十 本文于1996-12-09收到，1997-03-14修回 国家自然科学基金项目资助 3（9380012) 376 遗 传 学 报 25卷 lac,QlacZDM151｝为本室保存。载体pUC118和PUC119由本室保存。克隆有FD-TAP的 重组质粒pTAP362,pTAP118B,pTAPI19B和pTAPI18K由本工作中构建。 1.1.2培养基 TH培养基18［1:0.3％蛋白陈，0.3%酵母抽提物，0.2%NaCl,PHT0。固体培 养基为液体培养基稀释I倍后加1.5％琼脂粉。大肠杆菌丰富培养基：1％蛋白陈，0.5％酵 母抽提物，0.5%NaCl,pH7.0。固体培养基另加1.5％琼脂粉。2YT培养基：1.6％蛋白陈， 0.5％酵母抽提物，0.5%NaCl,pH7.0e 1.1.3 酶及生化试剂 各类限制性内切酶,T4DNA连接酶和DNA聚合酶Klenow大 片段购自美国NewEnglandBiolabs公司或Promega公司。低熔点琼脂糖凝胶、IPTG和 X-gal购自Sigma公司。对硝基苯磷酸二钠盐p（NPP）为Merck产品。 1.2 方法 1.2.1DNA操作 染色体DNA的抽提方法根据文献 9［]。质粒DNA的抽提采用碱变 J隆法，质粒DNA的纯化用氯化艳超离心法。DNA酶切、末端填补和连接均按 《分子克隆》 操作手册进行[21［00.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳后割胶回收DNA酶切片段，用Clontech公 司的Agar-outKit(Cat.No.K1210-1)进行纯化，操作按说明书。