原核表达-iptg诱导表达原理及试验步骤.pdfVIP

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 原核表达-IPTG诱导表达原理及实验步骤 在原核蛋白表达体系中 ，如 E.coli （大肠杆菌表达系统 ），外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达 ，本 文详细讲述了常用诱导剂 IPTG诱导原理 ，对外源蛋白诱导表达原理以及实验步骤。 原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列 ，且密集于染色体上 ，共同形成一个转录单位——操纵子 ， 也称基因表达的协同单位。E.coli 的乳糖操纵子含 Z、Y 及 A 三个结构基因 ，分别编码β-半乳糖苷酶 （β -galactosidase ）、通透酶 （permease ）和乙酰基转移酶 （transacetylase) ；此外还有调控基因 ：操纵序列 O （operator ）、启动序列 P （promoter ）；而 I(编码 Lac 阻遏物 ，Lac repressor)不属于乳糖操纵子。 乳糖操纵子结构基因 IPTG诱导原理 Lac 阻遏物是一种具有 4 个相同亚基的四级结构蛋白 ，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时 ，lac 操纵子 （元 ）处于阻遏状态 ，Lac 阻遏物 （即下图中的阻遏蛋白 ）能与操纵基因O结合 ，阻碍 RNA 聚合酶与 P序 列结合 ，阻止了转录的路径 ，从而抑制转录启动。而当有诱导剂 （这里指 IPTG ）存在时 ，诱导剂可与阻遏蛋白结合 ，使阻遏蛋白构象发生变化 ， 导致阻遏物从操纵基因O上解离下来 ，RNA 聚合酶不再受阻碍 ，启动子 P开始发生转录 ，启动反应开始发生转录。 在这个操纵子 （元 ）体系中 ，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入 细胞 ，经β-半乳糖苷酶催化 ，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。而在 实验中 ，通常选用异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG ）作为诱导剂 ，IPTG是一 Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 种作用极强的诱导剂 ，不被细菌代谢而十分稳定 ，因此被实验室广泛应用。 IPTG诱导表达实验方法 材料 试剂和培养基 配料  酵母膏 （Yeast extract) 5g LB （Luria—Bertani ）培养基  蛋白胨(Peptone) 10g  NaCl 10g  琼脂(Agar) 1-2%  蒸馏水 1L pH 7.0 IPTG 贮备液  2g IPTG 溶于 10mL蒸馏水中 0.22μm滤膜过滤除菌 ，分装成 1mL/份 ，-20℃保存 凝胶电泳加样缓冲液  50mmol/L Tris-CL(pH6.8)  50mmol/L DTT  2%SDS （电泳级 ）  0.1％溴酚蓝  10％甘油 原核表达鉴定详细实验步骤 1. 表达鉴定第一天的任务 ，常用抗性选择根据感