干酪乳杆菌l-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及酶-微生物学报.pdfVIP

微生物学通报 OCT 20, 2011, 38(10): 1482−1487 Microbiology China © 2011 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ 研究报告 干酪乳杆菌 L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的 表达、纯化及酶学性质 袁剑 秦浩 葛向阳 张伟国* (江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122) 摘 要: L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)是发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L- 乳酸的关键酶。以干酪乳杆菌G-02 (Lactobacillus casei G-02)基因组DNA 为模板, 克隆得到L-LDH 基因(ldhL), 经序列分析后将其连接到表达载体 pET-28a(+)上, 构建成重组质粒 pET-ldhL 转化到 大肠杆菌BL21(DE3) 中, 实现ldhL 基因的表达。30 °C 加入IPTG 诱导表达后, 经镍柱亲和层析纯 化的重组蛋白样品通过 SDS分析, 约在40 kD 处出现显著的特异性条带。对表达的L-LDH 生物学特异性研究显示: 重组L-LDH 的比酶活为1 722 U/mg, 最适反应温度为40 °C−45 °C; 果 糖-1,6-二磷酸(FBP)为别构激活剂, 使最适pH 向中性方向偏移(pH 为6.6−6.8), Mn2+ 可拓宽最适酶 活pH 范围; Mn2+ 、Ca2+和Mg2+ 对L-LDH 有激活作用, 而Zn2+ 对L-LDH 有抑制作用。 关键词: 干酪乳杆菌, L-乳酸脱氢酶, 克隆, 亲和层析, 酶学性质 Overexpression, purification and properties of ldhL gene from Lactobacillus casei in Escherichia coli YUAN Jian QIN Hao GE Xiang-Yang ZHANG Wei-Guo* (Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education , Jiangnan University , Wuxi, Jiangsu 214122, China) Abstract: L-lactate dehydrogenase (L-LDH) is a key enzyme which catalyzes the formation of L-lactate from pyruvate in the Lactobacillus sp.. The gene ldhL encoding L-LDH was amplified from genome DNA of Lactobacillus casei using PCR technique. The PCR product was cloned into pUcm-T vector and double digested with restriction endonucleases, and then the DNA fragment of ldhL was in- serted into pET-28a(+). The recombinants expression plasmid pET-ldhL was obtained, and wa