重组人gpx7的原核表达纯化及其抗肿瘤活性检测.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（７）：１９ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 研究报告檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪 重组人ＧＰｘ７的原核表达、纯化及其抗肿瘤活性检测 陈欣麟　钱秀萍　朱建伟　戈　梅　陈代杰　毛文伟 （上海交通大学药学院微生物与生化药学实验室　上海　２００２４０） 摘要　研究大肠杆菌表达重组人谷胱甘肽过氧化物酶７（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ７，ＧＰｘ７），并对纯 化精制的重组人ＧＰｘ７进行体内抗肿瘤活性检测。以质粒ｐＣＤＮＡ３．１（）ＧＰｘ７为模板，ＰＣＲ扩增 获得Ｎ端去除信号肽的ＧＰｘ７基因片段，构建的重组质粒ｐＥＴ２４ＡＧＰｘ７在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中 诱导表达。采用Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ强阳离子交换层析和Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５分子排阻层析纯化精制获得原核表 达的重组人ＧＰｘ７蛋白。该蛋白的体外催化活性微弱，但Ｓ１８０荷瘤小鼠连续１４ｄ注射ＧＰｘ７蛋白 后，肿瘤生长受到抑制，抑制率为２９．２６％，与对照组相比具有显著差异。实验结果表明，采用阳 离子交换和分子排阻层析两步法可纯化精制原核表达的重组人 ＧＰｘ，重组人 ＧＰｘ７蛋白在荷瘤小 鼠模型中表现出体内抗肿瘤活性。 关键词　重组人ＧＰｘ７　纯化　肿瘤增殖抑制 中图分类号　Ｑ７８ 　　谷胱甘肽过氧化物酶家族（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ， 值得探索的肿瘤新疗法［１１１２］。 ＧＰｘ）是以辅酶ＧＳＨ作为质子供体，将氧化型底物作为 　　ＧＰｘ７在细胞中的高表达能够缓解 ＲＯＳ对机体细 质子受体，催化氧化型底物还原的一类过氧化物分解 胞的损伤 ［２，１３］。小鼠移植高表达ＧＰｘ７的肿瘤细胞后， 酶。截至目前为止，ＧＰｘ家族中共有８个家族成员，包 实验组的肿瘤细胞增殖与对照组相比显著被抑制，表 ［１］ ［１４］ 括 ＧＰｘ１到 ＧＰｘ８ 。ＧＰｘ７（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ． 明ＧＰｘ７对肿瘤增殖的抑制作用值得研究 。因此，本 ／ ＋／＋ ＢＣ０３２７８８．１）是２００４年通过比较 Ｂｒｃａ１ 和 Ｂｒｃａ１ 研究旨在通过大肠杆菌进行重组人ＧＰｘ７的原核表达， ［２］ 鼠胚胎成纤维细胞的 ｍＲＮＡ表达芯片中被发现 。 采用阳离子交换以及分子排阻层析对表达产物进行纯 ＧＰｘ７与ＧＰｘ家族的其他成员不同，其酶催化活性中心 化，并将纯化的ＧＰｘ７以皮下注射的方式输送至荷瘤小 以半胱氨酸替代稀有氨基酸硒半胱氨酸。 鼠体内，探讨重组人 ＧＰｘ７对肿瘤细胞增殖的影响，为 　　活性氧 （ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）包括超氧自 ＧＰｘ７蛋白功能的后续研究奠定基础。 － 由基 （Ｏ ）、羟自由基 （ＯＨ·）、过氧化氢（ＨＯ）以 ２ ２ ２ １　材料与方法 及有机类的脂质羟基过氧化物（ＲＯＯＨ），是机体细胞的 ［３］ １．１　质粒、菌株、细胞株、实验动物 生理代谢过程中所产生的一系列副产物 。越来越多 的证据表明，各种致癌因素皆能导致细胞内ＲＯＳ的上 　　原核表达质粒ｐＥＴ２４Ａ和真核表达质粒ｐＣＤＮＡ３． ［４８］ 升，使得正常细胞向癌细胞发展 。此外，肿瘤细胞 １（）ＧＰｘ７由本实验室保存、ｐＥＴ２４ＡＧＰｘ７由本实验室 中高浓度活性氧