纤维连接蛋白肝素结合域多肽在昆虫表达系中表达及活性鉴定.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（６ｓ）：３２～３８ 纤维连接蛋白肝素结合域多肽在昆虫表达 系中表达及活性鉴定 １，２ １ １ １ １ １ 邹起练 　陈元仲 　陈小芳 　吴　勇 　陈　萍 　黄美娟 （１福建省血液病研究所 福建医科大学附属协和医院血液科　福州　３５０００１） （２福建医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学系　福州　３５０００４） 摘要　目的：将纤维连接蛋白Ｎ端和Ｃ端两个肝素结合域基因片断克隆至昆虫表达系统中进行 表达，分离纯化所表达多肽并进行多肽结合肝素、ＦＮ抗原性和抗血小板减少内毒素血症活性鉴 定。方法：用高保真ＰＣＲ技术从ＦＮｃＤＮＡ中扩增目的基因片段，将目的基因片段克隆至昆虫表达 系的ＢａｃｔｏＢａｃ ＨＴＶｅｃｔｏｒ，在Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ 中抗氨苄青霉素选择，挑选阳性菌斑通过ＰＣＲ、酶切  α ＴＭ 鉴定和ＤＮＡ序列测定，确定无误，再扩增提取质粒，进一步转染 ＭＡＸＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂａｃ  ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉ，经三种抗菌素（卡那、庆大、四环素）联合ＩＰＴＧ、Ｘｇａｌ蓝白斑选择，挑取阳性白色 菌斑提取质粒，ＰＣＲ、酶切鉴定和 ＤＮＡ序列测定，确定无误，转染Ｓｆ９昆虫细胞获取重组杆状病 毒，重组杆状病毒再次转染Ｓｆ９昆虫细胞表达多肽。裂解Ｓｆ９昆虫细胞，ＳＤＳＰＡＧＥ分析裂解上 清，镍离子亲和树脂分离纯化表达的多肽，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定多肽结合肝素和ＦＮ抗原性活性。动 物实验探讨ｒｈＦＮＨＣ３６多肽抗血小板减少内毒素血症的作用。结果：纤维连接蛋白Ｎ端和 Ｃ端 两个肝素结合域多肽均在昆虫表达系统中得到表达，所表达的多肽具有与肝素结合的能力而不 具ＦＮ抗原性。动物实验初步显示ｒｈＦＮＨＣ３６多肽具有抗血小板减少内毒素血症的作用。结论： 在昆虫表达系统中表达纤维连接蛋白Ｎ端和 Ｃ端两个肝素结合域多肽是可行的，所表达多肽具 生物活性，但表达量尚较低，有待进一步优化表达以提高表达量。 关键词　纤维连接蛋白　肝素结合域　多肽　昆虫表达系统 中图分类号　Ｑ７８６ 　　纤维连接蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＦＮ）是广泛存在于细胞 域、肝素结合结构域、纤维蛋白结合结构域和胶原蛋白 外基质中的一种糖蛋白，其结构是由３种不同类型的 ［１～３］ 结合结构域等 。 内在序列同源结构（ 型、 型、 型同源结构）重复出 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 　　ＦＮ通过与胶原、纤维蛋白、肝素、ＤＮＡ及细胞发生 现而构成。其中 型同源结构重复出现１２个， 型同 Ⅰ Ⅱ 专一性结合，影响细胞形态，维持组织器官整体性，参 源结构重复出现２个， 型同源结构至少重复出现 １６ Ⅲ 与粘附、移动、增殖、分化、吞噬等功能。ＦＮ还具有组 个。 型同源结构位于Ｎ端（９个）和Ｃ端（３个），与 Ⅰ 织特异性和功能多样性，与血小板聚集、正常凝血块的 肝素、纤维蛋白结合相关。 型同源结构仅２个，位于 Ⅱ 形成、组织损伤的修复、胚胎发育、免疫反应、感染性炎 第六个和第七个 型同源结构之间，与胶原蛋白结合 ［４，５］