构建质粒克隆.pptVIP

第八步：验证 (3) 谢谢，敬请批评指正！ 克隆连接 平端连接 难连接 粘端连接 易连接 如何构建质粒克隆 目的基因 目的载体 Bax pCMV-Sport 6 EcoRⅠ BglⅡ 连接Bax基因至EGFP载体 思路 加入 EcoRⅠ酶切位点 加入 BglⅡ 酶切位点 连接 ↑ 酶切 ↑ 目的基因两侧加入酶切位点 MCS 多克隆位点 Bax pCMV-Sport 6 缺点： 无荧光：GFP、Dsred 无标签: Flag、 HA、 Myc pCMVSPORT6 MCS Gene： BAX MGC: 20956, IMAGE:4578562 Insert site：EcoRI, XhoI 构建过程 ★ 设计引物 (增加酶切位点, BglⅡ, EcoRⅠ) 目的基因PCR 双酶切载体 (BglⅡ, EcoRⅠ) 琼脂糖凝胶电泳 DNA 胶回收 ( 基因 ,载体) 双酶切目的基因 (BglⅡ, EcoRⅠ) 目的基因与载体相连 DH5α转化 鉴定 第一步：设计目的基因PCR引物目的：1）通过PCR方法扩增目的基因2）在目的基因片断两端增加酶加位点 ★酶切位点旁需加入保护碱基 设计引物前需解决的问题 ? 1、选择酶切位点 ? 2、选择保护碱基 ? 3、终止密码子 PEGFP MCS 选择酶切插入位点： 1、两个酶切位点间隔远 2、目的基因序列中无相应酶切位点 3、酶切缓冲液一致 ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ BAX insert sequence atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctga enzyme BAX buffer Sal Ⅰ 0 XhoⅠ 1 2,3,4 EcoR Ⅰ 0 1,2,3,4 BamHⅠ 1 Bgl Ⅱ 0 3 PstⅠ 0 BclⅠ 0 * * DNAStar软件 - MapDraw功能 AGATCT ---- BglⅡ buffer 3 GAATTC ----EcoR I buffer 3 AGATCT 目的基因 CTTAAG AGATCT ---目的基因--- CTTAAG PCR产物 产物酶切效率低、不准确 ！！ 酶切位点保护碱基 protection seqence: GGAAGATCTTCC 2h=25%, 20h90% CCGGAATTCCGG 2h90%, 20h90% 切割率 提高酶切活性、增加酶切效率、缩短酶切时间 保护碱基: 限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响 Ire1的质粒，traf2的质粒，stat3的质粒，rack1的质粒，srebp的质粒，s6k的质粒，parkin的质粒，lc3b的质粒，p62的质粒，nfkb的质粒，p65的质粒，定位线粒体的gfp质粒mito-gfp，定位内质网的gfp质粒，定位高尔基体的gfp质粒，测atp含量的fret质粒，测钙的fret质粒等，cfp、gfp、yfp等各种工具质粒，有需要的联系Q：309739995 设计引物原则 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp， 引物序列的GC含量一般为40-60% 2. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条