蒲娟-中国农业大学动物医学院.docVIP

中国农业大学 本科生“URP”立项申请书 项目名称 禽流感病毒M1蛋白 杆状病毒系统表达及纯化 申 请 人 蒲 娟 工作单位 动物医学院 联系电话 电子信箱 pujuan@cau.edu.cn 填表日期 2017.4.18 中国农业大学教务处制 项目名称 禽流感病毒M1蛋白杆状病毒系统表达及纯化 项目起止时间 2017.6-2018.6 项目申请人情况 姓名 蒲娟 性别 女 出生日期 1979.8 最后学历与学位 博士研究生 博士 专业技术职务 副教授 从事专业 预防兽医学 项目概况 禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正粘病毒科流感病毒A属。该病毒广泛感染家禽，引起隐性感染、呼吸道症状、产蛋下降，死亡率接近100%的严重症状等不同程度的症状，给养殖业造成了严重的损失。此外，频繁发生的禽流感病毒感染人事件，提示了禽流感病毒引起人间流感大流行的可能性。因此，禽流感病毒具有养殖业和公共卫生的双重意义，在国际上引起了普遍的高度重视。 基质蛋白M1占流感病毒总蛋白量的40%，它在病毒囊膜内侧形成基质层并包围着病毒的vRNP，起着维持病毒结构形态的作用。除了结构蛋白功能外，M1蛋白还对新合成的vRNP的核输出起着关键作用，它与NEP蛋白、vRNP形成三元复合物介导vRNP出核。M1在病毒装配和出芽的过程中也发挥着重要的作用，M1蛋白与囊膜蛋白的胞内尾部结构域相互作用，同时也与vRNP相互作用，协助或招募病毒组分转运到出芽区域进而影响病毒的装配。大量证据表明M1蛋白上的某些突变位点对病毒粒子的形态在丝状和球状之间的转化起着决定作用。基于以上原因，M1蛋白一直是流感病毒蛋白研究的热点。 通过生物工程体外表达并纯化蛋白，是开展蛋白研究工作的基础。在以往相关研究中，M1蛋白都是通过大肠杆菌原核表达获取的，这样取得的蛋白不能精确反应天然蛋白的正确折叠或糖基化修饰等翻译后修饰。因此，我们拟采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统这一真核表达体系获取M1蛋白。该系统具有表达量高、蛋白折叠正确、翻译后修饰精确、可溶性表达等诸多优势。构建过程中，通过在N端添加蜂毒肽信号肽序列，使M1能够分泌到昆虫细胞外。在M1蛋白氨基端添加His标签，这样在表达之后可以通过亲和层析纯化目的蛋白。 基于以上几点，本项目拟通过杆状病毒-昆虫细胞表达体系表达流感病毒M1蛋白，并对蛋白进行初步纯化，为M1蛋白的进一步研究奠定基础。 实施计划及方案(明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法) 通过鸡胚扩繁实验室保存的H9N2病毒，应用RNA提取试剂盒从尿囊液中提取病毒RNA，通过RT-PCR试剂盒扩增M1片段。使学生掌握扩繁流感病毒、病毒基因提取与鉴定、基因扩增等基本病毒学操作。 将分泌性表达信号肽序列（蜂毒肽信号肽）、添加了His标签的M1基因序列分别克隆到穿梭质粒pFastBac1的多克隆位点；将该质粒转化含有杆状病毒基因组Bacmid和辅助质粒的DH10Bac工程菌，通过蓝白斑筛选出重组有目的基因片段的阳性克隆。并提取重组Bacmid。使学生掌握质粒构建、转化、阳性克隆筛选等分子生物学基本操作。 重组Bacmid转染昆虫细胞sf21，拯救出第一代重组杆状病毒，并通过连续传代对重组病毒进行扩大培养至第四代。通过噬斑试验，确定每一代次重组病毒的滴度。通过应用第四代病毒感染悬浮培养的sf21细胞摸索表达条件（MOI值、培养时间等）。最后通过感染较大规模悬浮培养的sf21细胞表达M1蛋白。使学生系统掌握杆状病毒拯救、病毒滴度测定、昆虫细胞培养、蛋白表达条件摸索等操作。 将悬浮细胞离心后，收集上清，将上清通过蠕动泵流过镍亲和层析柱。再通过PBS缓冲液过柱洗去一部分杂蛋白。应用含有不同浓度咪唑的缓冲液依次流过层析柱，分别收集并通过SDS鉴定洗下来蛋白的纯度。将含有纯的M1蛋白的收集液通过离心浓缩管进行浓缩后，应用透析袋进行透析，除去咪唑成分，之后将M1蛋白继续浓缩至需要的浓度。使学生掌握蛋白纯化和蛋白成分鉴定的试验操作。 技术路线： 三、项目实施的基础和条件 中国农业大学动物医学院预防兽医学实验室是农业部预防兽医学重点开放实验室。近年来，实验室一直开展流感病毒相关的研究工作，保存了一系列亚型和各个宿主来源的流感病毒株，为流感病毒的监测和蛋白功能研究奠定了重要基础。实验室拥有成熟的分子生物学研究平台，并建设有杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达平台，可以应用于上述项目的开展。 四、学生提交的成果 1．流感病毒M1蛋白杆状病毒表