目的对钠泵α亚基第二个膜外区MM4蛋白进行纯化-第三军医大学学报.DOCVIP

人钠泵α2亚基M4～M5区片段的克隆、原核表达与纯化 刘志文1，连易水2，张玥1，王永利1，2，王伟1，赵兴茹1，崔京霞1 （1.河北医科大学药学院，石家庄050017；2.河北医科大学基础医学院药理教研室，石家庄050017） 摘要： 目的 构建钠泵α2亚基第四跨膜区与第五跨膜区之间的蛋白结构域M4-5的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法 通过PCR反应和酶切技术，构建表达载体pET28b(+)-M4-5，并于大肠杆菌E.coli Rosetta2进行表达，用6mol/L盐酸胍对表达形成的不溶包涵体进行变性，梯度稀释复性后，用Ni-NTA亲和柱进行纯化，得到目的蛋白，用Western blotting分析表达产物。结果 成功构建了表达载体pET28b(+)-M4-5，并在大肠杆菌Rosetta2中得到了高效表达，表达量占细胞全蛋白的30%左右；SDS分析表明，表达产物主要以包涵体形式存在，亲和柱纯化后，目的蛋白的纯度在98%以上。结论 成功克隆表达出人钠泵α2亚基M4～M5膜内区蛋白M4-5，为进一步探讨钠泵α2亚基的生物学功能及研究钠泵在体内的作用机制奠定了基础。 关键词： 钠泵α2亚基；表达纯化；包含体；复性 中图分类号： Q786 文献标识码： A Cloning, Prokaryotic expression and purification of