小鹅瘟强毒CZ株的细胞适应毒的培育和部分生物学特性的测定.pdfVIP

家禽传染病 小鹅瘟强毒CZ株的细胞适应毒的培育和部分生物学特性的测定 刘岳龙·孙志李清孙谦秦爱建·金文杰邵红霞 (扬州大学兽医学院江苏扬州225009) 细胞适应毒能使GEF产生以细胞圆缩、脱落为特征的细胞病变(CPE)。用单抗介导的间接免疫荧光法 ，的延长而阳性细胞的检出量增加。用抗GPV的鹅源多抗和单抗做双抗体夹心ELISA，检测出不同代次细 胞适应毒的结果和IFA检测结果一致，并且细胞适应毒的培养液中病毒含量明显高于强毒的鹅胚尿囊液中 强。蚍0．2ml 后的第10天可检出抗体在GEF上的中和效价，22．28天达到高峰中和效价(达26”””)，随后缓慢下降。 关键词：小鹅瘟病毒(GPV)，细胞适应毒，生物学特性 1956年，方定一等在国际上首先发现Td,鹅瘟，并随后分离出小鹅瘟病毒【II。小鹅瘟的病原是鹅细小 病毒(Goose 因此对小鹅瘟病原学和疾病防制的研究很为重要。 GPV病毒毒力型主要有强毒和人工培育的弱毒。GPV的毒力致弱途径主要有二种：(1)强毒株在鹅 胚或番鸭胚中连续传代；(2)强毒株在体外培养细胞中连续传代。由于目前GPV在鹅群中感染率较高， 导致鹅胚内普遍存在抗GPV的母源抗体，干扰胚内病毒复制；而在体外培养细胞中复制病毒，则可以避 免上述母源抗体的干扰，因此，利用体外细胞进行GPV的复制和毒力致弱研究更有优势。但是，GPV对 体外细胞培养物的专一性很强。在试验过的鸭胚的成纤维细胞和肝细胞、鸡胚成纤维细胞、兔肾上皮细胞、 小鼠胎儿成纤维细胞、猪的肾上皮细胞和睾丸细胞以及PK．15细胞等，均未见病毒增殖。GPV仅可以在鹅 胚成纤维细胞(GEF)或番鸭胚成纤维细胞(MDEF)中培养t21。 J．等(1974)对B株，日本TakeharaJ．等(1994) 对GPV在GEF或MDEF的培养，主要有匈牙利的Kisary 方法的差异．其研究结果也各有不同。但是，更主要的一点是，他们主要依赖在光学显微镜下对GPV感 染细胞的病变特征(CPE)的观察来判定，而没有运用抗GPV的多克隆抗体或单克隆抗体进行免疫学系统 检测，以期培育出细胞适应毒并判定准确的病毒在GEF中的复制适应期，并进行毒力、免疫原性等生物学 澳9定等。 1材料和方法 1．1病毒： 小鹅瘟病毒CZ株是本室2004年在江苏常卅【地区的发病鹅群中分离、鉴定井保存的鹅胚 源(第二代)毒株。CZ株在SPF鸡胚中盲传后未能复制。病毒无血凝特性。经过等体积氯仿抽提处理后， CZ株对鹅胚的感染性不受影响。用相应的单克隆抗体进行检测，已经排除了鸡新城疫病毒、禽流感病毒 (H5亚型和H9亚型)、减蛋综合征病毒、网状内皮增生性病毒、禽白血病病毒(J亚群)等病原的混合感 染。CZ株病毒对无母源抗体的非免疫番鸭胚所检测的ELD，o指数分别是104I／0．2ml。 制各成GPV琼扩抗原，通过琼脂扩散试验(AGP)检测雏鹅血清抗体为阴性。 免疫成年鹅后的高免血清进行饱和硫酸铵盐析浓缩(约5倍)的产物，经紫外分光检测仪检测蛋白浓度为 832 第六次全国会员代袁大会暨第11次学术研讨会 该单抗株的免疫原是田间初代强毒株，单抗亚类是IgG2b。该单抗具有很强的体内、外中和活性，也具有 所以细胞培养和病毒传代的方法有所改进．具体如下：制备鹅胚次代GEF。立即将CZ株的含毒鹅胚尿囊 液滴加入上述GEF培养物，连续培养5．10天；再收集细胞培养液继续加入到下一代GEF培养液中，剂量 株的细胞适应毒命名为CZ-ca株。 的羊抗鼠IgG的商品化抗体(Sigma公司)。 1．6GPV CZ-ca株在GEF内感染的最早捡出时间的测定：将GPVCZ株病毒的第14代细胞传代毒 行4个平行重复验证。 CPE。以抗GPV的单抗作IFA检测。以Karber法统计TCID50。 阅读仪检测OD490的吸光值。 根据棋盘方阵法预试验结果，确定鹅源抗GPV免疫球蛋白的最佳包被最 尿囊液为阴性对照。同时再以NDV 对照。 1．9GPV CZ胚毒和细胞毒CZ-ea株对雏鹅致病性比较；将GPVcz抹第3代鹅胚尿囊液0．25ml和细 只，连续饲养并观察致病和死亡情况。同步设立5只未感染鹅为