小鼠t-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 徐惠娟 等/小鼠T-bet 启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定 1733 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn November 25, 2014, 30(11): 1733−1741 DOI: 10.13345/j.cjb.140093 ©2014 Chin J Biotech, All rights reserved 生物技术与方法 T-bet 徐惠娟，周守标 241000 , . T-bet . , 2014, 30(11): 1733–1741. Xu HJ, Zhou SB. Construction and identification of luciferase reporter gene containing mouse T-bet promoter. Chin J Biotech, 2014, 30(11): 1733–1741. 摘 要: 为了研究T-bet 在T 细胞中的转录调控机制，并研究其在多发性硬化症中的信号通路，本研究构建小 鼠TBX21 (编码T-bet) 基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠 TBX21 基因 5ʹ侧翼 区进行详尽生物信息学特征分析后，设计相应引物，用PCR 的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21 基因 5ʹ侧翼 区–1 000 bp−28 bp 片段长为1 028 bp 的启动子区 ( 以翻译起始点ATG 为+1) 和–3 308 bp−–2 000 bp 片段长为1 308 bp 的非编码区保守序列 (No-coding conserved sequence, CNS) ，再用定向克隆的方法将这两个片段定向重 组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体 (pGL4.10) 中，构建出包含小鼠TBX21 基因启 动子区和 CNS 区的萤火虫荧光素酶报告基因载体 (pGL4.10-TBX21pr-CNS) ，电泳与测序鉴定，最后再将 pGL4.10-TBX21pr-CNS 与内参pRL-TK 用lipofectamine 2000 共转染293T 细胞和Jurkat 细胞中，通过双荧光 素酶报告基因检测系统鉴定 pGL4.10-TBX21pr-CNS 的启动子和增强子活性，并用独立样本t 检验方法进行统 计分析。对照组共转染 pGL4.10 与内参 pRL-TK 。结果表明，成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒 pGL4.10-TBX21pr-CNS 。与转染空质粒pRL-TK 组相比，293T 细胞 (P ＝0.012 2) 和Jurkat 细胞 (P ＝0.002 2) 中 转染 pGL4.10-TBX21pr-CNS 组荧光素酶活性升高。研究结果表明在 293T 细胞和 Jurkat 细胞中 pGL4.10-TBX21pr-CNS 可以表现出启动子活性，为后续小鼠T-bet 转录调控研究提供了基本材料。 : T-bet ，启动子，荧光素酶，报告基因，转录调控 Received: February 21, 2014; Accepted: March 18, 2014 Supported by: Natural Science Foundation of Anhui Province (No. 77), Key Foundation of Education Department of Anhui Province (No. KJ2011A129). Corresponding author: Shoubiao Zhou. Tel: +86-553-5910810; E-mail: zhoushoubiao@ (No.77) (No