转录激活因子样效应物核酸酶介导的山羊β-乳球蛋白基因敲除和人乳铁.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 宋绍征 等/转录激活因子样效应物核酸酶介导的山羊β-乳球蛋白基因敲除和人乳铁蛋白基因定点整合 329 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn March 25, 2016, 32(3): 329−338 DOI: 10.13345/j.cjb.150299 ©2016 Chin J Biotech, All rights reserved 动物及兽医生物技术 β- 1,2 1 1,2 1 1 1 1 1,2 宋绍征 ，朱孟敏 ，袁玉国 ，荣耀 ，徐晟 ，陈思 ，梅珺琰 ，成勇 1 225009 2 225009 , , , . β- . , 2016, 32(3): 329–338. Song SZ, Zhu MM, Yuan YG, et al. BLG gene knockout and hLF gene knock-in at BLG locus in goat by TALENs. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 329–338. 摘 要: 为了敲除山羊乳中致敏源 β-乳球蛋白 (BLG) 基因，同时在 BLG 基因座定点整合人乳铁蛋白 (hLF) 基因。首先针对山羊BLG 第3 外显子识别位点设计了 1 对特异性TALEN-3-L/R 质粒对；同时，构建了含有 1 个 HSV-TK 负筛选基因的hLF 基因打靶载体 BLC14-TK 。TALENs 质粒对转染山羊胎儿成纤维细胞，2 µg/mL 嘌 呤霉素筛选3 d ，PCR 扩增产物测序来验证其切割DNA 活性。打靶载体BLC14-TK 与TALEN-3-L/R 质粒对共 转染山羊胎儿成纤维细胞，经700 µg/mL G418 和2 µg/mL GCV 共筛选药物抗性细胞株；通过整合检测和同源 重组检测来筛选hLF 基因打靶细胞株；BLG–/hLF +打靶细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植。结果为： TALEN-3-L/R 致突变率为25%−30%；获得BLG–/hLF +打靶细胞6 株；共制作重构胚胎 335 枚，移植受体山羊 23 只，B 超检测到30−35 d 的妊娠受体9 只 (妊娠率39.1%) ，其中1 只50 日龄克隆胎儿验证为BLG–/hLF +基 因型。以上结果表明获得BLG 基因座定点整合hLF 基因的基因打靶山羊是可行的，为培育羊乳中含低致敏原 和富含hLF 的山羊新品系奠定了基础。 : TALENs ，人乳铁蛋白，BLG ，基因打靶，体细胞核移植 Received: June 28, 2015; Accepted: October 15, 2015 Supported by: National Major Special Projects on New Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2011ZX08008-004), Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, Graduate Research and Innovation Projects in Yangzhou University (No. CXLX-1435). Corresponding author: Yong Cheng. Tel: +86-514 E-mail: ssz0610@163.com (No. 2011ZX08008-004) (No. CXLX-1435) 2015-11-11 /